ניתוח Immunoprofiling של דגימות רקמה FFPE הגידול הפך מרכיב חיוני של מחקרים חיסונית-אונקולוגיה, במיוחד עבור גילוי של אימות של סמנים ביולוגיים חזוי הרומן על חיסוני סרטן בהקשר של ניסויים קליניים1 ,2. IHC הדפסות כסף, שימוש chromogens כימיים כגון diaminobenzidine, נשאר טכניקה סטנדרטית בפתולוגיה אבחון עבור immunolabeling של ביופסיה רקמות3. IHC רגיל יכול לשמש גם עבור סרטן רקמות immunoprofiling, כולל את כימות של subpopulations של לימפוציטים סרטניים הקשורים והערכה של רמות הביטוי של מחסומים מערכת החיסון כגון ליגנד מוות תאים מתוכנת 1 (PD-L1)4 ,5. IHC רגיל הוא מוגבל, אולם זה אנטיגן אחד בלבד יכול להיקרא לכל סעיף הרקמה. מאחר immunoprofiling מחקרים דורשות בדרך כלל הניתוח של הביטוי בשילוב של מספר סמנים, השימוש IHC סטנדרטי ידרוש צביעה של רקמת מקטעים מרובים, אחד צבעונית עם סמן בודד, ויהיה, לכן, מוגבל באופן משמעותי לניתוח של דגימות רקמה קטנות כגון ביופסיות מחט הליבה. בשיטות הרגילות IHC מוגבלים גם להערכה של סמנים הן coexpressed על ידי אוכלוסיות מגוונות תא, כפי שמקובל עם סמנים מחסום מערכת החיסון כגון PD-L1, הבאה לידי ביטוי על ידי מקרופאגים סרטניים הקשורים והן תאים סרטניים. מגבלה זו דווחה על-ידי פתולוגים לניתוח כמותי של סמן IHC לידי תא מגוון סוגי6ב, למשל, השימוש הרגיל monoplex IHC. התפתחות טכניקות IHC הדפסות כסף מולטיפלקס העסקת מגוונות chromogens צבעוניים על מייצג סעיף זהה רקמת קידום על פני השיטה IHC monoplex סטנדרטי,7 למרות הם נשארים מוגבל על-ידי immunolabeling של כמה סמני ולהציג גם מהווה אתגר טכני חשוב על הערכה נכונה של סמני לידי ביטוי באותו התאים subcellular של אוכלוסיות תאים באותו.
ההליכים הנ ל לגבי זמינות הרקמה דגימות קליניות, כמו גם המגבלות של מולטיפלקס טכניקות IHC הדפסות כסף, נתנו עלייה על הצורך לפתח שיטות מולטיפלקס משופרת ללימודי חיסונית-אונקולוגיה בהתאם תיוג פלורסנט בשילוב עם מערכות זה יעיל יכול להפריד את האותות של fluorophores מרובים לאותה השקופית הדמיה. טכניקה אחת כזו מבוססת על tyramide אות הגברה (TSA) בשילוב עם מיקרוסקופ מולטי ספקטריאליות הדמיה עבור צבע יעיל ההפרדה8. ערכת מבוסס-TSA זמינים מסחרית מעסיקה fluorophores אופטימיזציה עבור הדמיה מולטי ספקטריאליות8 (ראה טבלה של חומרים). יתרון קריטי של מערכת זו הוא התאימות שלו עם אותו ללא תווית העיקרי נוגדנים כבר מאומת, אופטימיזציה עבור תקן הדפסות כסף IHC9,10,11. פעולה זו מאפשרת לא רק אופטימיזציה מהירה יותר, אלא גם גמישות ב השינויים אופטימיזציה ו לוח שילוב מטרות חדשות. יתר על כן, ניתן למטב את שיטת TSA מולטיפלקס immunofluorescence (mIF) זמינים מסחרית במערכות הוספת גוון לסמלים IHC אוטומטי, המאפשר העברה ישירה של monoplex IHC הדפסות כסף כדי mIF.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור לוח mIF ללימודי חיסונית-אונקולוגיה המבוסס על אוטומטי mIF TSA מכתים ומשתמש בסורק מולטי ספקטריאליות עבור הדמיה. פרוטוקול זה יכול להיות הותאם, שונה על ידי כל משתמש מעבדה עם גישה מכשור המתואר, ריאגנטים. הפרוטוקול כולל פאנל של שישה ראשי נוגדנים עבור immunoprofiling של קרצינומות: PD-L1, PD-1, CD68 (כמו סמן פאן-מקרופאג), CD8 (תאי T-ציטוטוקסיות), Ki-67, ו AE1/AE3 (פאן-cytokeratin, משמש סמן אפיתל לצורך הזיהוי קרצינומה של תאים). מחקר שנערך לאחרונה מתאר אופטימיזציה של פרוטוקול mIF TSA ידנית באמצעות הדפסות כסף IHC כהפניה סטנדרטי כדי לאמת את תירגע צביעת12. השיטה מעודכן המובאת כאן פותחה באמצעות ערכת TSA זמינים מסחרית, שבע-צבע באופן ממוכנת הוספת גוון לסמלים, באופן דרסטי קיצור הזמן מכתימים מ 3 – 5 ימים ש 14, תוך גם שיפור מרקם של ההכתמה מיטבי. בנוסף הראשי פרוטוקול מפורט המובאת כאן, מקטע תוספת חומרים כולל שיטת "טיפה-שליטה", תהליך בקרת איכות נוספים כדי להעריך את פאנל mIF חדש, כמו גם הערות טכניות עבור אופטימיזציה, פתרון בעיות, פיתוח של פאנלים מולטיפלקס חדשים כדי לסייע למשתמש מעבדה כדי להגדיר ולמטב את השיטה TSA mIF לפאנלים mIF מותאם אישית.