Pannello di immunofluorescenza Multiplex automatizzato per gli studi di Immuno-oncologia su campioni di tessuto in formalina Carcinoma

Immunoprofiling analisi dei campioni di tessuto tumorale FFPE è diventata una componente essenziale degli studi di immuno-oncologia, in particolare per la scoperta e validazione di nuovi biomarcatori predittivi per immunoterapia del cancro nel contesto di studi clinici^{1 ,2}. Cromogenico IHC, utilizzando cromogeni chimici quali diaminobenzidina, rimane la tecnica standard in patologia diagnostica per il immunolabeling di biopsia del tessuto³. IHC standard può essere utilizzato anche per il cancro del tessuto immunoprofiling, compresa la quantificazione delle sottopopolazioni dei linfociti tumore-collegati e la valutazione dei livelli di espressione di checkpoint immuni come ligando di morte programmata delle cellule 1 (PD-L1)^{4 ,5}. IHC standard è limitata, tuttavia, in quanto solo un antigene possa essere etichettato per ogni sezione del tessuto. Perché gli studi immunoprofiling in genere richiedono l'analisi dell'espressione combinata di parecchi indicatori, l'uso di IHC standard richiederebbe la colorazione di sezioni di tessuto più, ciascuno macchiato con un singolo marker e, pertanto, sarebbe limitata sostanzialmente per l'analisi di piccoli campioni di tessuto quali le biopsie dell'ago di nucleo. Metodi standard di IHC sono anche limitati per la valutazione degli indicatori che sono coespressi di popolazioni di cellule diverse, come è comune con gli indicatori checkpoint immuni quali PD-L1, che è espresso da macrofagi associati al tumore e cellule tumorali. Questa limitazione è stata segnalata in, ad esempio, l'uso di standard Levansucrasi IHC dai patologi per l'analisi quantitativa di un marcatore IHC espresso dalla cella diversi tipi⁶. Lo sviluppo di tecniche IHC cromogenici multiplex che impiegano diversi cromogene colorate sulla stessa tessuto sezione rappresenta un avanzamento sopra il metodo standard di Levansucrasi IHC,⁷ anche se rimangono limitato dalla immunolabeling di pochi marcatori e presenti anche un'importante sfida tecnica per la corretta valutazione di marcatori espressi nei compartimenti subcellulari stessi delle stesse popolazioni cellulari.

Le suddette avvertenze relative alla disponibilità di tessuto da campioni clinici, così come le limitazioni delle multisala cromogenici tecniche IHC, hanno dato origine alla necessità di sviluppare metodi migliori multisala per studi di immuno-oncologia basati su Contrassegno fluorescente combinati con sistemi che possono efficacemente separare i segnali di fluorofori più dalla stessa diapositiva di imaging. Una tale tecnica è basata sull'amplificazione di segnale di microarray (TSA) combinato con formazione immagine di microscopia multispettrali per colore efficiente separazione⁸. Un kit disponibile in commercio basati su TSA impiega fluorofori ottimizzato per imaging multispettrale⁸ (Vedi Tabella materiali). Un vantaggio fondamentale di questo sistema è la sua compatibilità con gli anticorpi primari senza etichetta stessi che già sono stati convalidati e ottimizzato per standard cromogenico IHC^9,10,11. Questo consente non solo di ottimizzazione più veloce ma anche di flessibilità le modifiche al pannello e ottimizzazione che incorporano nuovi obiettivi. Inoltre, il metodo di immunofluorescenza multiplex (mIF) TSA può essere ottimizzato per commercialmente disponibili sistemi automatizzati di stainer IHC, consentendo per un semplice trasferimento da Levansucrasi cromogenico IHC MIF.

Qui presentiamo un protocollo per un pannello di mIF per studi di immuno-oncologia che si basa su mIF TSA colorazione automatizzata e utilizza uno scanner multispettrale per l'imaging. Questo protocollo può essere adattato e modificato da qualsiasi utente di laboratorio con accesso alla strumentazione descritta e reagenti. Il protocollo include un pannello di sei anticorpi primari per l'immunoprofiling dei carcinomi: PD-L1, PD-1, CD68 (come marcatore pan-macrofago), CD8 (cellule T citotossiche), Ki-67 e AE1/AE3 (vaschetta-cytokeratin, utilizzato come indicatore epiteliale per l'identificazione di cellule di carcinoma). Un recente studio descrive l'ottimizzazione di un protocollo di mIF TSA manuale utilizzando cromogenico IHC come uno standard di riferimento per convalidare il multiplex macchiatura¹². Il metodo aggiornato qui presentato è stato sviluppato utilizzando un kit TSA commercialmente disponibili, sette colori ottimizzato in un coloratore automatico, accorciando drasticamente il tempo di colorazione da 3 – 5 giorni alle 14h, migliorando anche la consistenza della colorazione. Oltre al protocollo principale dettagliato presentato qui, una sezione di Materiali supplementari include il metodo "goccia-control", un processo di ulteriore controllo di qualità per valutare un nuovo pannello di mIF, come pure le note tecniche per l'ottimizzazione, risoluzione dei problemi e lo sviluppo di nuovi pannelli multiplex per aiutare l'utente di laboratorio per configurare e ottimizzare il metodo TSA mIF per pannelli personalizzati mIF.