免疫腫瘍学研究、特に発見と臨床試験1 のコンテキストでの癌免疫療法の新規予測バイオ マーカーの検証のために不可欠なコンポーネントとなっている FFPE 腫瘍組織サンプルの Immunoprofiling 分析 ,2。ジアミノベンジジンなど化学色原体を使用して、発色の IHC 病理生検組織3の反応の標準的な手法のままです。標準 IHC はがん組織 immunoprofiling、腫瘍関連リンパ球のサブポピュレーションとプログラムされた細胞死配位子 1 など免疫チェックポイントの発現レベルの評価 (PD L1)4 の定量などにも使用できます。 ,5。標準 IHC は限られた、しかし、ティッシュ セクションごとに 1 つだけ抗原のラベル付けできます。Immunoprofiling 研究は、通常いくつかのマーカーの組み合わせの式の解析を必要とするため複数の組織切片の染色標準 IHC の使用が必要になります, 各単一のマーカーの染色し、したがって、コア針生検など小さい組織サンプルの解析に大幅に制限されます。標準 IHC 法または PD L1、腫瘍関連マクロファージおよび癌細胞によって表現されるなど免疫チェックポイント マーカーよくの多様な細胞集団で行ったマーカーの評価のために制限されます。この制限は、標準 monoplex IHC の使用などのさまざまな細胞タイプ6によって表される IHC マーカーの定量分析のための病理学者によって報告されています。ちょうど少数の反応によって制限されているものの、標準 IHC monoplex 方法、7以上同じティッシュ セクションを表すの多様な塗装色原体の進歩を用いた多重発色 IHC 技術の開発マーカーも同じ細胞集団の同じ細胞内コンパートメントに発現するタンパク質の適切な評価のための重要な技術的な課題を提示。
多重の発色 IHC 法の制限と同様、臨床サンプルから組織の可用性に関する上記の注意事項は、腫瘍免疫研究に基づく多重化法の改良を開発する必要性に上昇を与えています。蛍光標識は、同じスライドから複数の同時の信号を分離することができます効果的にシステムをイメージングと組み合わせます。このような手法の 1 つは、効率的な色分離8のマルチ スペクトル顕微鏡イメージングと組み合わせるパスチラミドシグナル信号増幅 (TSA) に基づいています。市販の TSA ベース キット採用 fluorophores マルチ スペクトル イメージング8用に最適化 (材料の表を参照してください)。このシステムの重要な利点は、検証および標準的な発色 IHC9,10,11用に最適化された同じ非標識一次抗体との互換性です。これは、新しいターゲットを組み込む最適化とパネルの変更で高速化だけでなく、柔軟性をことができます。Monoplex からの簡単な転送を可能にする、自動化された市販の IHC 着色システムのための多重蛍光 (mIF) TSA メソッドの最適化さらに、mIF に発色 IHC。
ここで腫瘍免疫研究に基づいている mIF パネル自動 mIF TSA 染色とイメージングのための多重分光スキャナーを使用してプロトコルを提案します。このプロトコルは、適応および記述されている計測・試薬へのアクセスを持つ研究室ユーザで変更できます。プロトコルには、癌の immunoprofiling の六つの一次抗体のパネルが含まれています: PD-L1、PD 1、CD68 (パン ・ マクロファージ マーカー) として、CD8 (T 細胞傷害性細胞)、キ-67 と AE1/AE3 の同定に上皮性マーカーとして使用 (汎サイトケラチン、癌細胞)。最近の研究では、染色12多重化を検証するための標準の参照として発色 IHC を使用して手動 TSA mIF プロトコルの最適化について説明します。自動着色剤、また染色の一貫性を向上させながら 14 時間 3-5 日から染色時間を飛躍的に短縮で最適化された市販の七色の TSA キットを使用して更新されたメソッドここで紹介をしました。ここで示した詳細な主なプロトコル、に加えて補足資料セクションには「ドロップ コントロール」法、最適化ためのテクニカル ノートと同様、新しい mIF パネルを評価する追加の品質管理プロセスが含まれていますトラブルシューティング、およびセットアップおよびカスタマイズされた mIF パネルの mIF TSA メソッドを最適化する研究所ユーザーを支援する新しい多重パネルの開発。