Immunoprofiling analyse van FFPE tumor weefselsteekproeven uitgegroeid tot een essentieel onderdeel van immuno-oncologie studies, met name voor de detectie en validatie van nieuwe voorspellende biomarkers voor kanker immunotherapie in het kader van klinische proeven1 ,2. Chromogenic IHC, met behulp van chemische chromogens zoals diaminobenzidine, blijft de standaard techniek in diagnostische pathologie voor de immunolabeling van de biopsie weefsel3. Standaard IHC kan ook worden gebruikt voor kanker weefsel immunoprofiling, met inbegrip van de kwantificatie van de subpopulaties van tumor-geassocieerde lymfocyten en de beoordeling van de niveaus van de expressie van immuun checkpoints zoals geprogrammeerde cel dood ligand 1 (PD-L1)4 ,5. Standaard IHC is echter beperkt, in die slechts één antigeen kan worden gelabeld per weefselsectie. Omdat immunoprofiling studies vergen doorgaans de analyse van de gecombineerde uitdrukking van verschillende markeringen, het gebruik van standaard IHC zou vereisen de kleuring van meerdere weefselsecties, elk gekleurd met een enkele gegevensmarkering, en daarom zou aanzienlijk beperkt voor de analyse van kleine weefselsteekproeven zoals kern naald biopsieën. IHC standaardmethoden zijn ook beperkt zijn voor de beoordeling van de markeringen die zijn coexpressed door diverse cel populaties, zoals gebruikelijk is bij immuun checkpoint markeringen zoals PD-L1, die wordt uitgedrukt door zowel de kankercellen als de tumor-geassocieerde macrofagen. Deze beperking is gemeld in, bijvoorbeeld, het gebruik van standaard monoplex IHC door pathologen voor de kwantitatieve analyse van een marker van de IHC uitgedrukt door diverse cel typen6. De ontwikkeling van een multiplex chromogenic IHC technieken met divers gekleurde chromogens op de dezelfde weefsel sectie vertegenwoordigt een vooruitgang over de IHC monoplex standaardmethode,7 hoewel ze blijven beperkt door de immunolabeling van slechts een paar Markeringen en ook een belangrijke technische uitdaging voor de juiste beoordeling van markeringen uitgedrukt in de dezelfde subcellular compartimenten van de dezelfde cel populaties aanwezig.
De voornoemde beperkingen met betrekking tot de beschikbaarheid van het weefsel van klinische monsters, evenals de beperkingen van multiplex chromogenic IHC technieken, hebben aanleiding gegeven tot de noodzaak tot het ontwikkelen van verbeterde multiplex methoden voor immuno-oncologie studies op basis van fluorescerende labeling gecombineerd met beeldvormende systemen die effectief de signalen van meerdere fluorophores van de dezelfde dia scheiden kunnen. Een dergelijke techniek is gebaseerd op tyramide signaal versterking (TSA) in combinatie met multispectrale microscopie imaging voor efficiënte kleur scheiding8. Een commercieel beschikbare TSA gebaseerde kit maakt gebruik van fluorophores geoptimaliseerd voor multispectrale imaging8 (Zie Tabel van materialen). Een cruciaal voordeel van dit systeem is de verenigbaarheid ervan met de dezelfde labelloze primaire antilichamen die reeds zijn gevalideerd en geoptimaliseerd voor standaard chromogenic IHC9,10,11. Hierdoor niet alleen sneller optimalisatie, maar ook flexibiliteit in de optimalisatie en paneel wijzigingen opnemen van nieuwe doelen. Bovendien, de methode van de TSA multiplex immunofluorescentie (mIF) kan worden geoptimaliseerd voor commercieel beschikbare geautomatiseerde IHC stainer systemen, waardoor voor een eenvoudige overdracht van monoplex chromogenic IHC aan mIF.
Hier presenteren we een protocol voor een mIF paneel voor immuno-oncologie-studies die is gebaseerd op mIF TSA kleuring geautomatiseerde en een multispectrale scanner voor imaging gebruikt. Dit protocol kan worden aangepast of gewijzigd door elk laboratorium gebruiker met toegang tot de beschreven instrumentatie en reagentia. Het protocol bevat een panel van zes primaire antilichamen voor de immunoprofiling van carcinomen: PD-L1, PD-1, CD68 (als een pan-macrofaag marker), CD8 (cytotoxische T cellen), Ki-67, en AE1/AE3 (pan-cytokeratin, gebruikt als een epitheliale merker voor de identificatie van carcinoom cellen). Een recente studie beschrijft de optimalisatie van een handmatige TSA mIF protocol met behulp van chromogenic IHC als standaard referentie voor het valideren van de multiplex12kleuring. De bijgewerkte methode hier gepresenteerd is ontwikkeld met behulp van een commercieel beschikbaar, zeven-kleur TSA kit geoptimaliseerd in een geautomatiseerd brandschilderen, drastisch verkorten van de kleuring tijd van 3 – 5 dagen tot 14 h, terwijl ook het verbeteren van de consistentie van de kleuring. Naast het gedetailleerde belangrijkste protocol hier gepresenteerd, bevat een sectie Aanvullende materialen de "drop-control"-methode, een extra kwaliteitscontrole proces te evalueren van een nieuw mIF deelvenster, evenals technische notities voor de optimalisatie, probleemoplossing en ontwikkeling van nieuwe multiplex panelen om de laboratorium-gebruiker instellen en optimaliseren van de mIF TSA methode voor aangepaste mIF panelen te helpen.