Zautomatyzowany multipleksowy panel immunofluorescencyjny do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek raka utrwalonego formaliną

Analiza immunoprofilowania próbek tkanek nowotworowych FFPE stała się istotnym elementem badań immunoonkologicznych, szczególnie w celu odkrycia i walidacji nowych biomarkerów predykcyjnych dla immunoterapii nowotworów w kontekście badań klinicznych1^,2. Chromogenne IHC, wykorzystujące chemiczne chromogeny, takie jak diaminobenzydyna, pozostaje standardową techniką w patologii diagnostycznej do immunoznakowania tkanek biopsyjnych³. Standardowy IHC może być również stosowany do immunoprofilowania tkanek nowotworowych, w tym do ilościowego oznaczania subpopulacji limfocytów związanych z nowotworem oraz oceny poziomów ekspresji immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak ligand programowanej śmierci komórki 1 (PD-L1)^4,5. Standardowy IHC jest jednak ograniczony, ponieważ tylko jeden antygen może być znakowany na każdy wycinek tkanki. Ponieważ badania immunoprofilowania zazwyczaj wymagają analizy połączonej ekspresji kilku markerów, zastosowanie standardowego IHC wymagałoby barwienia wielu odcinków tkanki, z których każda jest barwiona jednym markerem, a zatem byłoby znacznie ograniczone do analizy małych próbek tkanek, takich jak biopsje gruboigłowe. Standardowe metody IHC są również ograniczone do oceny markerów, które są współwyrażane przez różne populacje komórek, jak to ma miejsce w przypadku markerów immunologicznych punktów kontrolnych, takich jak PD-L1, który ulega ekspresji zarówno przez makrofagi związane z nowotworem, jak i komórki rakowe. Ograniczenie to zostało zgłoszone na przykład w przypadku stosowania przez patologów standardowego monopleksu IHC do analizy ilościowej markera IHC wyrażanego przez różne typy komórek⁶. Rozwój multipleksowych technik chromogennych IHC wykorzystujących różne kolorowe chromogeny na tym samym wycinku tkanki stanowi postęp w stosunku do standardowej metody monopleksowej IHC, ⁷, chociaż pozostają one ograniczone przez znakowanie immunologiczne zaledwie kilku markerów, a także stanowią ważne wyzwanie techniczne dla właściwej oceny markerów wyrażonych w tych samych subkomórkowych przedziałach tych samych populacji komórek.

Wyżej wymienione zastrzeżenia dotyczące dostępności tkanek z próbek klinicznych, jak również ograniczenia technik multipleksowych chromogenicznych IHC, spowodowały potrzebę opracowania ulepszonych metod multipleksowych dla badań immunoonkologicznych opartych na znakowaniu fluorescencyjnym w połączeniu z systemami obrazowania, które mogą skutecznie oddzielać sygnały wielu fluoroforów z tego samego szkiełka. Jedna z takich technik opiera się na wzmocnieniu sygnału tyramidu (TSA) w połączeniu z obrazowaniem za pomocą mikroskopii wielospektralnej w celu efektywnej separacji kolorów⁸. Dostępny na rynku zestaw oparty na TSA wykorzystuje fluorofory zoptymalizowane pod kątem obrazowania wielospektralnego⁸ (patrz Tabela Materiałów). Krytyczną zaletą tego systemu jest jego kompatybilność z tymi samymi nieznakowanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi, które zostały już zwalidowane i zoptymalizowane pod kątem standardowego chromogennego IHC^9,10,11. Pozwala to nie tylko na szybszą optymalizację, ale także na elastyczność w optymalizacji i modyfikacjach paneli o nowe cele. Co więcej, metoda TSA immunofluorescencji multipleksowej (mIF) może być zoptymalizowana pod kątem dostępnych na rynku zautomatyzowanych systemów barwienia IHC, co pozwala na proste przejście z monopleksowego chromogenicznego IHC na mIF.

Tutaj prezentujemy protokół dla panelu mIF do badań immunoonkologicznych, który opiera się na automatycznym barwieniu mIF TSA i wykorzystuje skaner wielospektralny do obrazowania. Protokół ten może być dostosowywany i modyfikowany przez każdego użytkownika laboratoryjnego mającego dostęp do opisanego oprzyrządowania i odczynników. Protokół zawiera panel sześciu podstawowych przeciwciał do immunoprofilowania raków: PD-L1, PD-1, CD68 (jako marker panmakrofagów), CD8 (komórki T-cytotoksyczne), Ki-67 i AE1/AE3 (pan-cytokeratyna, stosowana jako marker nabłonkowy do identyfikacji komórek rakowych). Niedawne badanie opisuje optymalizację ręcznego protokołu TSA mIF przy użyciu chromogennego IHC jako standardowego odniesienia do walidacji barwienia multipleksowego¹². Przedstawiona tu zaktualizowana metoda została opracowana przy użyciu dostępnego na rynku, siedmiokolorowego zestawu TSA zoptymalizowanego w automatycznym barwieniu, drastycznie skracającego czas barwienia z 3-5 dni do 14 godzin, przy jednoczesnej poprawie konsystencji barwienia. Oprócz przedstawionego tutaj szczegółowego protokołu głównego, sekcja Materiały uzupełniające zawiera metodę "kontroli zrzutu", dodatkowy proces kontroli jakości w celu oceny nowego panelu mIF, a także uwagi techniczne dotyczące optymalizacji, rozwiązywania problemów i opracowywania nowych paneli multipleksowych, aby pomóc użytkownikowi laboratorium w skonfigurowaniu i optymalizacji metody mIF TSA dla niestandardowych paneli mIF.