Immunoprofiling análise de amostras de tecido de tumor FFPE tornou-se um componente essencial de estudos imuno-oncologia, particularmente pela descoberta e validação de novos biomarcadores preditivos para imunoterapia no contexto dos ensaios clínicos1 ,2. IHC cromogênico, usando chromogens químicas tais como diaminobenzidina, continua a ser a técnica padrão no diagnóstica patologia para o immunolabeling de biópsia de tecido3. IHC padrão também pode ser usado para immunoprofiling de tecido de câncer, incluindo a quantificação de subpopulações de linfócitos tumor-associado e a avaliação dos níveis de expressão de pontos de verificação imunes como ligante de morte celular programada 1 (PD-L1)4 ,5. IHC padrão é limitada, no entanto, em que apenas um antígeno pode ser rotulado por seção de tecido. Immunoprofiling estudos normalmente requer a análise da expressão combinada de vários marcadores, o uso do IHC padrão exigiria a coloração das várias secções de tecido, cada uma manchada com um marcador único e, portanto, seria substancialmente limitado para a análise de amostras de tecido pequenas tais como biopsias de agulha. Métodos padrão de IHC também são limitados para a avaliação de marcadores que são coexpressed por populações de diversas células, como é comum com marcadores de ponto de verificação imune como PD-L1, que é expressa pelo tumor-associado de macrófagos e células cancerosas. Essa limitação tem sido relatada em, por exemplo, o uso do padrão monoplex IHC por patologistas para análise quantitativa de um marcador IHC expressado pela célula diversos tipos6. O desenvolvimento de técnicas IHC cromogênico multiplex empregando diversas chromogens coloridas sobre o mesmo tecido seção representa um avanço sobre o método padrão de IHC monoplex,7 embora permaneçam limitados pelo immunolabeling de poucos marcadores e também apresentar um desafio técnico importante para a avaliação adequada dos marcadores expressado nos compartimentos subcellular mesmos das mesmas populações de células.
Os detalhes acima mencionados sobre a disponibilidade de tecido de amostras clínicas, bem como as limitações das técnicas IHC cromogênica multiplex, deram origem à necessidade de desenvolver métodos aperfeiçoados de multiplex imuno-Oncologia estudos baseados em etiquetando fluorescente combinado com sistemas que podem efetivamente separar os sinais de vários fluorophores mesmo slide de imagens. Uma tal técnica é baseada na amplificação do sinal de tyramide (TSA) combinada com imagens multiespectrais de microscopia para cor eficiente separação8. Um kit comercialmente disponível com base em TSA emprega fluorophores otimizado para geração de imagens multiespectrais8 (ver Tabela de materiais). Uma vantagem importante deste sistema é a sua compatibilidade com os anticorpos primários sem rótulo mesmos que já tenham sido validados e otimizado para padrão cromogênico IHC9,10,11. Isto permite não só a otimização mais rápida, mas também a flexibilidade nas modificações de otimização e painel incorporando novos destinos. Além disso, o método TSA multiplex imunofluorescência (mIF) pode ser otimizado para comercialmente disponíveis sistemas automatizados de corante IHC, permitindo para uma simples transferência de monoplex cromogênico IHC a mIF.
Aqui nós apresentamos um protocolo para um painel do Fumin para estudos imuno-Oncologia baseado em automatizada do Fumin TSA coloração e usa um scanner multi-espectral para a imagem latente. Este protocolo pode ser adaptado e modificado por qualquer usuário do laboratório com acesso à instrumentação descrita e reagentes. O protocolo inclui um painel de seis anticorpos primários para o immunoprofiling de carcinomas: PD-L1, PD-1, CD68 (como um marcador de pan-macrófago), CD8 (células T citotóxicas), Ki-67 e AE1/AE3 (pancitoqueratina, usado como um marcador epitelial para a identificação de células de carcinoma). Um estudo recente descreve a otimização de um protocolo de mIF TSA manual usando IHC cromogênico como um padrão de referência para validar os cinemas coloração12. O método atualizado aqui apresentado foi desenvolvido usando um kit TSA comercialmente disponível, sete cores otimizado em um corante automatizado, drasticamente, encurtando o tempo coloração de 3 – 5 dias para 14 h, melhorando também a consistência da coloração. Além do protocolo principal detalhado apresentado aqui, uma seção de Materiais complementares inclui o método de "gota-control", um processo de controle de qualidade adicional para avaliar um novo painel de mIF, bem como notas técnicas de otimização, solução de problemas e desenvolvimento de novos painéis multiplex para ajudar o usuário de laboratório para configurar e otimizar o método TSA do Fumin para painéis personalizados do Fumin.
Este protocolo é significativo porque a otimização do desenvolvimento e transferência de protocolos de imunofluorescência multiplex é complexa e desafiadora. Para muitos laboratórios, o dedo do dedo do dedo de um protocolo otimizado é inestimável. A imunofluorescência multiespectral nos permite avaliar tanto a localização quanto a identidade de vários tipos celulares dentro e ao redor do tumor.
Esta é uma poderosa combinação de informações em estudos de oncologia imunológica. O uso mais atraente para imunofluorescência multiplex é a oncologia imunológica. Mas a capacidade de examinar vários tipos de células imunes no setu pode ser aproveitada em todas as terapias autoimunes e inflamatórias.
Conhecer a localização e o fenótipo das células imunolíngues dentro e ao redor de células solidítures é uma resposta prognóstica e previsível à imunoterapia específica do tumor. A otimização e validação do protocolo são etapas-chave que não devem ser apressadas. Novos desenvolvedores devem se familiarizar com os novos tipos de artefatos associados à imagem multiespectral.
Para localizar o protocolo base multi-plex, pré-o precarregue-o no stainer automatizado. Filtrar para todos'em vez de preferir n