Immunoprofiling анализ образцов ткани тумора FFPE стала важным компонентом исследований иммуно онкологии, особенно для обнаружения и проверки Роман интеллектуального биомаркеров для иммунотерапии рака в контексте клинических испытаний1 ,2. Хромогенный IHC, используя химические chromogens например Диаминобензидин, остается стандартным методом диагностики патологии для immunolabeling биопсия тканей3. Стандартный IHC может также использоваться для immunoprofiling ткани рака, включая количественный субпопуляций лимфоцитов опухольассоциированных и оценки выражения уровни иммунных контрольно-пропускных пунктов как запрограммированной клеточной смерти лигандом 1 (PD-L1)4 ,5. Стандартный IHC является ограниченным, однако в том, что в разделе ткани могут быть помечены только один антиген. Потому что immunoprofiling исследования, как правило, требуют анализа комбинированных выражение несколько маркеров, использование стандартных IHC потребует пятнать несколько разделов ткани, каждый витражи с одного маркера и следовательно, будет существенно ограничены для анализа проб небольших ткани как биопсия иглы ядро. Стандартные методы IHC также ограничены для оценки маркеров, которые coexpressed на различных клеточных популяций, как это обычно происходит с маркерами иммунной контрольно-пропускной пункт, например PD-L1, которая выражается опухольассоциированных макрофагов и раковые клетки. Это ограничение сообщалось в, например, использование стандартных monoplex IHC патологоанатомами для количественного анализа IHC маркера, выраженных клеток различных типов6. Разработка методов мультиплекс хромогенных IHC используя разнообразные цветные chromogens на же представляет раздел ткани выдвижение над стандартным методом ИГХ monoplex,7 , хотя они остаются ограничивается immunolabeling из нескольких маркеры и также представляет важную техническую проблему для надлежащей оценки маркеров, выраженных в же субцеллюлярные отсеков же клеточных популяций.

Вышеупомянутые оговорки относительно наличия ткани из клинических образцов, а также ограничения мультиплекс хромогенных IHC методов, привели к необходимости разработки мультиплекс методов для исследования иммуно онкология, основанные на флуоресцентные метки в сочетании с изображений системы, которые могут эффективно отделить сигналы нескольких флуорофоров от тот же слайд. Один из таких методов на основе усиления сигнала tyramide (АСП) в сочетании с многоспектральной микроскопии изображений для эффективного цвета разделения8. Коммерчески доступных комплект на основе TSA применяет флуорофоров, оптимизированный для многоспектральных изображений8 (см. Таблицу материалы). Важнейшим конкурентным преимуществом этой системы является ее совместимость с же немеченого первичного антитела, которые уже были проверены и оптимизирован для стандартных хромогенных IHC9,10,11. Это позволяет не только быстрее оптимизации, но и гибкость в оптимизации и группа изменений, включения новых целей. Кроме того, метод TSA мультиплекс иммунофлюоресценции (МВС) могут быть оптимизированы для коммерчески доступных автоматизированных систем IHC Стайнер, позволяя для простой передачи от monoplex хромогенных IHC mIF.

Здесь мы представляем протокол МВС группа для исследования иммуно онкология, основанные на автоматизированных mIF TSA окрашивание и использует многоспектрального сканера для воображения. Этот протокол могут быть адаптированы и изменение пользователем любой лаборатории с доступом к описано оборудование и реагенты. Протокол включает в себя группу из шести первичных антител для immunoprofiling карциномы: PD-L1, ПД-1, CD68 (как маркер Пан макрофагов), CD8 (Т-цитотоксические клетки), Ki-67 и AE1/AE3 (pan Цитокератины, используется как эпителиального маркер для идентификации карцинома клетки). Недавнее исследование описывает оптимизации ручной TSA mIF протокола с помощью хромогенных IHC как стандартную ссылку для проверки мультиплекс, окрашивание12. Обновленный метод, представленные здесь была разработана с помощью коммерчески доступных, семь цветов TSA комплект оптимизированы в автоматизированных Стайнер, резко сокращая окрашивания время от 3 – 5 дней до 14 h, а также улучшение согласованности окрашивание. Помимо подробного основного протокола, представленные здесь в разделе Дополнительных материалов включает в себя метод «капля контроль», процесс дополнительного контроля качества для оценки новой группы МВС, а также технические примечания для оптимизации, Устранение неполадок и разработка новых мультиплекс панелей, чтобы помочь пользователю настроить и оптимизировать метод mIF TSA для заказной mIF панелей лаборатории.