Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

Bu yöntem, bulaşıcı hastalık alanında anahtar soruların cevapyardımcı olabilir. Dang humması ya da Chikungunya ateşi ile ilgili olarak. Bu tekniğin en büyük avantajı, viral RNA’yı basit ve hızlı bir şekilde ölçebilmesidir.

Bu yöntem temel bir virüs araştırmaiçgörü sağlayabilir rağmen, aynı zamanda insan popülojenik virüslere karşı ilaç tarama çalışması ve klinik tanı koymak yoluyla yüksek gibi diğer araştırmalara uygulanabilir. Bu yöntemin büyük gösteri önemlidir. Numune işleme pulları ve biyogüvenlik kabini çapraz kontaminasyon u veya laboratuvar enfeksiyonunu önlemek için önemlidir.

Prosedürü gösteren bir yardımcı doçent ve laboratuvarımızdan teknik yardımcımız olacaktır. RNA standardı için DNA şablonu hazırlandıktan sonra, in vivo transkripsiyon reaksiyonu ile hazırlanan DNA şablonunun 100 nanogramını 0,2 mililitrelik PCR tüpte karıştırın. Termocycler’da 37 derecede iki saat kuluçkaya yatın.

Bundan sonra, Bir mikrolitre DNAase ekleyin ve kuluçkaya 37 derecede 15 dakika devam edin. Bir RNA arıtma kiti ayarlayın ve 1,5 mililitrelik bir tüp reaksiyon karışımı% 1 betamarcaptoethanol dahil olmak üzere RNAase serbest su ve yakalama tampon 350 mikrolitre 80 mikrolitre ekleyin. % 100 etanol 250 mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için bir pipet kullanın.

Ardından, bir toplama tüpü yle bir RNA temizleme sütunu monte edin. RNA örneğini arınma sütununa aktarın. Sütunu 8,000 kez G’de 15 saniye santrifüj edin ve akışı atın.

Daha sonra, kolona 500 mikrolitre yıkama tamponu uygulayın ve 8,000 kez G’de iki dakika boyunca santrifüj uygulayın. Bundan sonra, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp içine sütun yerleştirin. RNAase ücretsiz su 50 mikrolitre ekleyin ve bir dakika oda sıcaklığında kuluçka.

RNA’yı allute için bir dakika boyunca maksimum hızda sütunsantrifuge. Bir spektrofotometre kullanarak, 260 nanometre de alluted RNA 3 mikrolitre optik yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, sentezlenen Dang virüs üç prime UTR RNA kopya numarasını belirleyin.

RNA standardını kullanıma hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, 199 mikrolitre işleme tamponunu bir mikrolitre nükleaz içermeyen proteinaz K.Hücre kültürü ortamını kullanarak, hazırlanmış Dang humması virüsünü 1’den 10’a kadar seyrelterek, 5, 000, 000 ile 5 arasında değişen konsantrasyonlarda RNA standartlarını elde etmek için pipetleme ve girdap tekrarlayın. Dang virüsü enfekte hücrelerin kültür supernatant 5 mikrolitre ve Dang virüsü 3 prime UTR RNA standart ya A2 PCR şeritler veya 96 iyi PCR plaka kuyuları.

İşleme tamponve proteinaz K.Centrifuge içeren çözeltinin beş mikrolitresini 200 kez G’de beş saniye boyunca karıştırın. Örnekleri 25 derecede bir termo cycler’da 10 dakika, sonra 75 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Dang virüsü kullanarak üç prime UTR özgü astar ve florojenik prob kullanarak, 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüp bir tek adım RT PCR reaktif ivedi rtq PCR ana karışımı hazırlamak.

Alloquote ana karışımı sekiz mikrolitre bir kuyu içine 96 iyi gerçek zamanlı PCR plaka. Daha sonra, 96 iyi gerçek zamanlı PCR plaka her kuyuya her örnek iki mikrolitre ekleyin. Plakayı optik olarak net yapışkan filmle kapatın.

Hava kabarcıklarını temizlemek için plakaları 200 kez G’de beş saniye santrifüj edin. Ardından, plakayı gerçek zamanlı PCR aletine yerleştirin. Gerçek zamanlı PCR ilişkili bir yazılım kullanarak, kurulum penceresine gidin ve bilinmeyen örnek olarak analiz edilecek bir reaksiyon kuyusu atayın.

Daha sonra, seri olarak seyreltilmiş Dang virüsü üç prime UTR RNA’nın kuyularını standart olarak atayın ve her kuyuda Beklenen RNA standardı numarasını yazın. Şablon olmayan denetimi negatif denetim olarak atayın. Ardından, RT PCR aracını başlatın ve metin protokolünde belirtildiği gibi plakayı döndürün.

Çözümleme penceresinde, analiz edin ve oluşturulan standart eğrinin korelasyon katsayısının 0,98’e eşit veya daha büyük olduğundan emin olun. Genellikle, çözümleme için varsayılan CT ayarlarını kullanın. Bu çalışmada, standart Dang virüsü RNA’nın seri on kat seyreltilmesi, üç prime UTR spesifik astar ve florjenik probu kullanılarak doğrudan RTQ PCR analizine tabi tutulmuştur.

Bu analizin doğrusal eğrisi korelasyonun iyi olduğunu göstermektedir. Daha sonra, bu doğrudan RTQ PCR testi virüs enfekte hücrelerin kültür supernatant Dang virüsü ölçmek için uygulanır. İyi bir korelasyon Dang virüs enfeksiyonu titreci ve CT arasında görülür, floresan sinyal arka plan üzerinde üstel büyüme ile yükselir noktası olarak kabul edilen bir döngü numarası.

Dang humması stokunun bilinen enfeksiyöz titreleri ile seri seyreltmeden oluşturulan CT değerleri önceden oluşturulmuş standart eğri üzerinde çizildiğinde, reaksiyon başına 08 ile 8, 000 PFU arasında değişen numunelere ait verilerin standart RNA’ya maruz kalanların aralığında olduğu görülmektedir. Bu, çok çeşitli enfeksiyöz titrelere sahip Dang humması virüs örneklerinin bu tekniği kullanırken aynı anda analiz edilebilmektedir. Bu teşp daha da Dang virüsüne karşı anti-viral ajanlar doğrulamak için uygulanabilirliği için değerlendirilir.

MPA mililitre başına 50 mikrogram ile tedavi edildiğinde, DMSO tedavi kontrol kültürünün yaklaşık% 99.87 bir azalma gözlenmektedir. Son olarak, diğer RNA virüsleri ile bu test uygulamaları test edilir. Sarı Humma Virüs 17D aşı suşu doğrudan RTQ PCR tabi olduğunda, standart bir eğri virüs titres ve CT değerleri arasında iyi bir doğrudan korelasyon ile oluşturulur.

Aynı şekilde, kızamık virüsü ve chikungunya virüs ham suşu doğrudan RTQ PCR analizi enfeksiyöz titreleri ve CT değerleri arasında iyi bir regresyon verir. Bu teknik tarama çalışması alanında araştırmacılar Için önünü açacaktır. Çok sayıda örneğin yeni antiviral ilaçları keşfetmesine izin vermek basiteşittir.

Yeniden enfeksiyöz malzemelerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman ve temiz bir biyogüvenlik kabini kullanımı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.