טיהור של Trypanosomes חוץ-תאית, כולל אפריקה, מן הדם על ידי אניון-מחליפי (Diethylaminoethyl-תאית עמודות)

טריפנוזומים אפריקאים אחראים על טריפאנוזומיה אפריקאית אנושית, או מחלת שינה ו trypanosomiasis אפריקאי בעלי חיים. טריפנוזומים הגורמים למחלות שינה הם טפילים פרוטיסטיים המועברים זבוב tsetse נוכחים מוקדים גיאוגרפיים רבים באפריקה שמדרום לסהרה. גילוי הטפיל חיוני לאבחון, טיפול ומעקב.

סרולוגיה יכולה לתת תוצאות שליליות שגויות ולצערי, כוזבות. כדי לסייע באיתור בדם, יש לרכז את הנסיפנוזומים. נעשה שימוש בטכניקות ריכוז טפילים שונות.

השיטה הרגישה ביותר היא הפרדת טפילים מדם על ידי טור של מחליף אניון, תאית DEAE ואחריו צנטריפוגה ותצפית מיקרוסקופית. כתוצאה מכך, שיטת תאית DEAE היא הטובה ביותר ונשארת עד כה, שיטת הייחוס להדמיה ובודדה של טפילים מדם לאבחון טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי, במיוחד בתנאי שדה. שיטה זו, האבחון ההולם ביותר עבור טריפנוסומיאזיס אפריקאי מספק גם טפילים מטוהרים עבור חקירות ביולוגיות, ביולוגיות, ביוכימיות, תרופות וביולוגיות מולקולריות.

כל החקירות תואמות את המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה וההסכם הושג מהרשויות הצרפתיות וכל הפרוטוקולים בהם נעשה שימוש אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית שלנו. לשקול כל חומר על פי הפרוטוקול בכתב. מוסיפים מים מזוקקים ומתאימים בדיוק ל-pH 8 עם אשלגן דיהידרוגן פוספט כדי ליצור את הפתרונות הבאים במאגר, מלוחים מרוכזים של מאגר פוספט 2X.

מוסיפים מים מזוקקים וגלוקוז לגלוקוז מלוחים במאגר פוספט. עבור 100 מיליליטר של חיץ אלוטיון, להוסיף 100 יחידות למיליליטר של פניצילין, 100 מיקרוגרם למיליליטר של סטרפטומיצין, וחמישה מיקרוגרם מיליליטר של פנול אדום לפוספט גלוקוז מלוחים במאגר. 100 גרם של תאית DEAE נשטף תחילה עם שלושה ליטרים של מים מזוקקים ולאחר מכן עזב להתיישב.

חלקיקים עדינים מושלכים. הכביסה חוזרת על עצמה עד שהעל-טבעי מתבהר. פוספט מרוכז אגף מלוחים 2X מתווסף ואת תאית DEAE הוא עורר.

ה- pH מותאם לשמונה עם אשלגן פוספט אחד. לאחר מכן התאית נשטפת פעמיים במים מזוקקים ופעמיים עם גלוקוז מלוחים במאגר פוספט. תאית DEAE וגלוקוז מלוחים במאגר פוספט מעורבבים בכמויות שוות.

סגסוגת רבעים ומאוחסנת בטמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס או במינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון ממושך. דם נגוע טריפנוזום מאוחסן בחנקן נוזלי. ליטר סגסוגת של מיליליטר אחד מופשר בטמפרטורת החדר.

טפילים נאספים בקפידה מההקפאה באמצעות מחט ומזרק מיליליטר אחד. הכדאיות של טפילים מופשרים מוערכת על ידי תנועתיות כפי שהודמיה על ידי תצפית מיקרוסקופית אור לפני ההדבקה. טפילים מוזרקים לחללים הציוניים של שני עכברים, 500 מיקרוליטרים לעכבר.

כל יום לאחר זיהום, טפיל מוערך על ידי איסוף טיפת דם מהזנב עם מחט נבדק על ידי מיקרוסקופיה. כאשר הטפיל הוא ברמה מתאימה, דם נגוע נאסף. מזרק 10 מיליליטר נתמך מלחציים או מחזיקים ופיסת נייר סינון חתוכה מראש מתווספת.

תאית DEAE מוכנה נשפכת לתוך המזרק עד לרמה של שמונה או תשעה מיליליטר. העמודה נשטפת עם מאגר האלוטיון. שני מיליליטר של דם נגוע ממוקם בקפידה על גבי העמוד ו trypanosomes נאספים בעמודה eluate בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.

חיץ אלוטיון מתווסף באופן קבוע על פי המעבר של טריפנוזומים. המעבר של טריפנוזומים דרך העמוד נבדק על ידי לקיחת טיפה של עמודה מרוממת במרווחי זמן קבועים והתבוננות טריפנוזומים באמצעות מיקרוסקופיה קלה. כאשר טריפנוזומים אינם נצפו עוד באלואט, הצינור חרוט הוא צנטריפוגה ב 1, 800 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

העל-טבעי מושלך ונסיפנוזומים במשטח נספרים בהמוציטומטר. טריפנוזומים שנאספו מדוללים לאחר מכן במדיום הנדרש לחקירה המתוכננת. שיטה זו, האבחון ההולם ביותר עבור טריפנוסומיאזיס אפריקאי מספק טפילים מטוהרים עבור חקירות ביולוגיות, ביולוגיות, ביוכימיות, פרמצבטיות ומולקולריות.

מחקרים אלה פותחו כי DEAE תאית טפילים מטוהרים ניתן להשיג בקלות בכמויות גדולות מן המארחים נגועים באופן טבעי או ניסיוני ובמיוחד, מכרסמים. יכולת הקיום Trypanosome בנוכחות סוכני תרופות מוערכת על ידי תצפית מיקרוסקופית. כדאיות טפיל קשורה תנועתיות ולכן, ניתן לבדוק על ידי העין תחת מיקרוסקופ אור ב 40 פעמים או הגדלה גבוהה יותר.

כדאיות טפיל מוערך על ידי מדידת אחוז צורות מוטיבציה. דילולים של תרכובות הבדיקה מתווספים לתוך כל באר של צלחת תרבות רקמה 96 היטב בעוד בארות שליטה מטופלים מדומה. כל ריכוז מוערך ב- triplicate.

מספר הטפילים קיימא עבור כל דילול מושווה למספר הטפילים בארות שליטה. ההשפעות של Pentamidine, תרופת ייחוס, בשימוש בטיפול טריפנוזומיאזיס אפריקאי אנושי מוצג דמות זו. תרבויות מקרופאג’ טריפנוזיות מאפשרות חקירה של אינטראקציה בין טפילים מארחים ברמה התאית.

ב תרבויות טפיל מקרופאג, טריפנוזומים תאיים נוספים לגרום לייצור של ארגיניאז מקרופאג כי הידרוליזה ארגינין כדי ornithine. Ornithine הוא מבשר של פוליאמינים ו trypanothione, חיוני להישרדות טפיל וצמיחה. יתר על כן, דלדול ארגינין מקטין את הייצור של תחמוצת החנקן trypanocidal.

לאחר מכן, תוספת של מעכב ארגינאז, S-L-ציסטאין לתרבויות שיתוף מפחית באופן דרמטי מקרופאג המושרה צמיחת טפיל. אינדוקציה ארגיניאז מתווך על ידי טריפנואז מופרש או מופרש גורמים. גורם גרימת ארגינאז זה זוהה כקינסין אורתיני.

הקינסין נקשר לקולטנים קשירה lectin סוג C. ארגינז הוא המושרה ומייצר ornithine אשר מעדיף צמיחת טפיל. ארגינאז אינו מושרה על ידי kinesin מקרופאגים מתורבת עם 12.5 מילימולרית mannose או מקרופאגים מעכברים שבו קולטני mannose מקרופאג נמחקו.

דוגמאות נוספות של ביולוגיה של התא ניסויים ביוכימיים באמצעות תאית DAEA טריפנוזומים מטוהרים מוכחים במחקרים שבהם חלבונים ציטוסקלטליים חדשניים כגון BILBO1 זוהה. BILBO1 נדרש עבור ביוגנזה של מבנים ציטוסקלטליים חשובים והישרדות טפילים. לכן, BILBO1 מייצג יעד חשוב להתערבות טריפנוזומים פתוגניים.

תמונה המציגה תיוג immunoflourescence של צורת תרבות מחזור הדם, טריפאנוסומה ברוסי תא נבדק עם נוגדן נגד BILBO1 מוצג באיור זה. בנוסף, חילוף החומרים של גלוקוז ותרנין תוארו באמצעות טריפנוזומים מטוהרים תאית DEAE והאנזימים המעורבים בתהליכים אלה אומתו באופן ניסיוני. ייצוג סכמטי של חילוף החומרים של גלוקוז ותרונין ב טריפנוזומים שנוצרו במחזור הדם מוצג בנתון זה.

טיהור של טריפנוזומים אפריקאים מדם על ידי חילופי אניון עמודי תאית DEAE עם השיפורים האחרונים נשאר תקן הזהב לגילוי trypanosome, לא רק מארחים טבעיים עם parasitemias נמוך באזורים אנדמיים, אלא גם עבור הדרישה של טפילים במספרים גדולים לחקירות ניסיוניות. חקירות אפשרו זיהוי של מולקולות trypanosome לשחק תפקידים חיוניים הישרדות טפיל וצמיחה. מטרות מזוהות עשויות לייצג את הבסיס לחיסון עתידי עם אנטיגנים פוטנציאליים הן לבני אדם והן לבעלי חיים בגישה בריאותית אחת.