Neuroscience
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चूहों में Lipopolysaccharide इंजेक्शन द्वारा प्रेरित उप तीव्र सेरेब्रल Microhemorrhages
Summary October 17th, 2018
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हम Sprague-Dawley चूहों में एलपीएस इंजेक्शन की वजह से CMHs के लिए प्रेरित और पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, जो रोगजनन के CMHs पर भविष्य में अनुसंधान जांच में उपयोग किया जा सकता है ।
Transcript
यह विधि सेरेब्रल माइक्रो-हेमरेज क्षेत्र जैसे एटियोलॉजी, वितरण और सेरेब्रल माइक्रो-हेमरेज का पता लगाने आदि में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि एलपीएस इंजेक्शन लगातार सूजन को प्रेरित करते हैं। इसके अलावा, एलपीएस इंजेक्शन काफी सरल, किफायती और लागत प्रभावी है।
हालांकि यह विधि सेरेब्रल हेमरेज प्रेरण में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसे अवसाद, सिजोफ्रेनिया, पार्किंसंस रोग, अल्जाइमर रोग और प्रिन रोग जैसे अन्य मस्तिष्क विकारों पर भी लागू किया जा सकता है। इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 10 सप्ताह पुराने पुरुष स्प्राग डावले चूहों को शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम एक मिलीग्राम की खुराक पर एलपीएस का प्रशासन करें, फिर प्रत्येक चूहे को घर के पिंजरे में वापस करें। एलपीएस इंजेक्शन को छह घंटे और 16 घंटे के बाद दोहराएं।
कृपया ध्यान दें कि एक मिलीग्राम प्रति किलोग्राम की खुराक पर एलपीएस के साथ एसडी चूहों को इंजेक्शन लगाने से 5% मृत्यु दर हो सकती है। मृत्यु दर छोटे या पुराने चूहों या गर्भवती मादा चूहों में और बढ़ सकती है। एलपीएस इंजेक्शन के बाद चूहों को उनके पिंजरों में लौटाएं, और भोजन और पेय के लिए विज्ञापन लिबिटम पहुंच प्रदान करें।
टर्मिनल संज्ञाहरण के तहत, प्रत्येक चूहे पर पांच से आठ मिलीमीटर गहरे हृदय पंचर प्रदर्शन करते हैं। पंचर बिंदु तीसरे और चौथे इंटरकोस्टल अंतरिक्ष में उरोस्थि के बाएं मार्जिन के लिए पांच मिलीमीटर होना चाहिए। जगह में सुई पकड़ो और इवांस नीले रंग युक्त एक ट्यूब के साथ खाली ट्यूब की जगह ।
रक्त वसूली मनाया जाता है जब तक रुको, और फिर बाएं दिल वेंट्रिकल में शरीर के वजन के १०० ग्राम प्रति ०.२ मिलीलीटर की एक खुराक पर इवांस नीले सुई । इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा रक्त/मस्तिष्क बाधा के माध्यम से इवांस ब्लू रिसाव का आकलन करते हुए चूहे को 10 मिनट के लिए एक रीढ़ की स्थिति में रखें । सेरेब्रल वैक्यूलेचर और दिमाग को साफ करने के लिए 0.9% खारा समाधान के बर्फ-ठंड 200 से 300 मिलीलीटर का उपयोग करके कार्डियक पर्फ्यूजन करें।
निर्धारण के लिए बर्फ-ठंड 4% पैराफॉर्मलडिहाइड पर स्विच करें। फिर, मस्तिष्क को अलग करने के बाद, इसे पीबीएस में कम से कम छह घंटे के लिए या जब तक मस्तिष्क ट्यूब के नीचे तक डूब नहीं जाता है, इसे 20% सुक्रोज में विसर्जित कर दें। समाधान को 30% सुक्रोज में बदलें और इसे अन्य छह घंटे के लिए ठीक करें।
अंत में, क्रायोस्टेट का उपयोग करके 10 मिलीमीटर मोटी मस्तिष्क ऊतक अनुभाग तैयार करें। पांच मिनट के लिए तीन बार पीबीएस के साथ स्लाइड धोएं, फिर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 4, 6'diamidino-2-phenylindole या DAPI समाधान के साथ स्लाइड incubate । पहले की तरह पीबीएस में स्लाइड्स धोने के बाद, पीबीएस-ग्लिसरोल समाधान के साथ स्लाइड्स माउंट करें।
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर छवियों को कैप्चर करें। ईबी बयान लाल फ्लोरेसेंस द्वारा इंगित किया जाता है, नाभिक नीले फ्लोरेसेंस द्वारा इंगित किया जाता है। आसुत पानी में स्लाइड धोने से एच एंड ई धुंधला शुरू करो।
फिर आठ मिनट के लिए हेमेटॉक्सीलिन समाधान में विसर्जित करें। वैकल्पिक रूप से, पर्ल प्रशिया ब्लू स्टेनिंग के लिए, 10 मिनट के लिए फेरोसाइनाइड और हाइड्रोक्लोरिक एसिड के बराबर भागों के मिश्रण के साथ प्रतिक्रिया समाधान में दाग। धुंधला होने के बाद, पांच मिनट के लिए नल के पानी को चलाने में धो लें।
30 सेकंड के लिए 1% एसिड अल्कोहल में अंतर करें। एक मिनट के लिए नल का पानी चलाने में धोने के बाद, 0.2% अमोनिया पानी या संतृप्त लिथियम कार्बोनेट समाधान में 30 सेकंड से एक मिनट के लिए दाग। इसके बाद, पांच मिनट के लिए नल के पानी को चलाने में धो लें।
30 सेकंड से एक मिनट के लिए ियोसिन समाधान के साथ काउंटर दाग। 90% शराब के माध्यम से निर्जलित, फिर 95% शराब, और प्रत्येक 0.5 से दो मिनट के लिए पूर्ण शराब। निर्जलीकरण के बाद, जाइलीन में 30 सेकंड के लिए स्पष्ट करें।
बढ़ते के बाद, एक ब्राइटफील्ड फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एच एंड ई धुंधला का विश्लेषण करें। रक्त वाहिकाओं से जारी लाल रक्त कोशिकाएं, जो सीएमएच के घटक हैं, एच एंड ई धुंधला के तहत लाल-नारंगी में दिखाई देती हैं। सतह सीएमएच का पता सकल अवलोकन द्वारा लगाया जा सकता है जैसा कि लाल तीर द्वारा इंगित किया गया है।
इवांस ब्लू धुंधला दिखाई लाल फ्लोरेसेंस से पता चलता है जहां इवांस नीले अणुओं एक घायल रक्त मस्तिष्क बाधा से लीक । एच एंड ई स्टेनिंग केशिकाओं के बाहर पाए जाने वाले लाल रक्त कोशिकाओं को दिखाता है, और प्रशिया धुंधला लाल रक्त कोशिकाओं के लाइसिस से प्राप्त फेरिक आयन बिंदुओं का पता चलता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, यह याद रखना महत्वपूर्ण है कि सेरेब्रल माइक्रो-हेमरेज को प्रेरित करने के लिए एलपीएस की खुराक पार्किंसंस रोग या सिजोफ्रेनिया मॉडल में उपयोग की जाने वाली तुलना में बड़ी है।
इसलिए मृत्यु दर को कम करने के लिए पशुओं के पर्यावरण को स्वच्छ रखा जाना चाहिए। इस प्रक्रिया के बाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, और इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग जैसे अन्य तरीकों को सेरेब्रल माइक्रो-हेमरेज में रक्त-मस्तिष्क बाधा की बाहरी संरचना को नुकसान निर्धारित करने, वीवो में मस्तिष्क परन्किमा में सेरेब्रल माइक्रो-हेमरेज के वितरण के साथ-साथ ग्लियल सेल सक्रियण का प्रदर्शन किया जा सकता है।
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