Neuroscience
You have full access to this content through Seoul National University of Education
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Sub akutt Cerebral Microhemorrhages av lipopolysakkarid injeksjon i rotter
Summary October 17th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterer en protokoll for å indusere og oppdage CMHs forårsaket av LPS injeksjon i Sprague-Dawley rotter, som kan benyttes i fremtiden forskning undersøkelser på patogenesen av CMHs.
Transcript
Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i cerebral mikroblødning felt som etiologi, distribusjon, og påvisning av cerebral mikroblødning og så videre. Den største fordelen med denne teknikken er at LPS injeksjoner stabilt indusere betennelse. I tillegg er LPS-injeksjon ganske enkel, økonomisk og kostnadseffektiv.
Selv om denne metoden kan gi innsikt i hjerneblødning induksjon, det kan også brukes på andre hjernesykdommer som depresjon, schizofreni, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, og prion sykdom. Administrer LPS i en dose på ett mg per kilo kroppsvekt til 10 uker gamle hannSprague Dawley rotter ved intraperitoneal injeksjon, og returner deretter hver rotte til hjemmeburet. Gjenta LPS-injeksjonen etter seks timer og 16 timer.
Vær oppmerksom på at injeksjon av SD-rotter med LPS med en dose på ett mg per kilo kan føre til 5 % dødelighet. Dødeligheten kan ytterligere øke hos yngre eller eldre rotter eller gravide hunnrotter. Returner rottene til burene sine etter LPS-injeksjon, og gi ad libitum tilgang til mat og drikke.
Under terminalbedøvelse utfører du en fem til åtte millimeter dyp hjertepunktering på hver rotte. Punkteringspunktet skal være fem millimeter til venstre margin av brystbenet på tredje og fjerde interkostalrom. Hold nålen på plass og skift ut det tomme røret med et rør som inneholder Evans blå.
Vent til blod utvinning er observert, og deretter injisere Evans blå i en dose på 0,2 milliliter per 100 gram kroppsvekt i venstre hjerte ventrikkel. Hold rotten i liggende stilling i 10 minutter hvis du vurderer Evans blå lekkasje gjennom blod/hjernebarrieren ved immunofluorescence imaging. Utfør hjerteperfusjoner ved hjelp av iskalde 200 til 300 milliliter med 0,9% saltløsning for å fjerne hjernevaskulaturen og hjernen.
Bytt til iskald 4% paraformaldehyd for fiksering. Deretter, etter å ha isolert hjernen, senk den i 20% sukrose i PBS i minst seks timer eller til hjernen synker til bunnen av røret. Endre løsningen til 30% sukrose og fikse den i ytterligere seks timer.
Til slutt, forberede 10-millimeter tykke hjernevev seksjoner ved hjelp av en kryostat. Vask lysbildene med PBS tre ganger i fem minutter hver, og inkuber deretter lysbilder med 4, 6'diamidino-2-fenylindol eller DAPI løsning i 15 minutter ved romtemperatur. Etter vask av lysbildene i PBS som før, monter lysbildene med PBS-glyserolløsning.
Ta bilder på et fluorescensmikroskop. EB-deponering indikeres med rød fluorescens, kjerner indikeres med blå fluorescens. Begynn H&E-fargingen ved å vaske skliene i destillert vann.
Senk deretter i hematoksylinløsning i åtte minutter. Alternativt, for Perl prøyssisk blå farging, flekk i reaksjonsløsning med like deler blanding av ferrocyanid og saltsyre i 10 minutter. Etter farging, vask i rennende vann fra springen i fem minutter.
Differensier i 1% sur alkohol i 30 sekunder. Etter vask i rennende vann fra springen i ett minutt, flekk i 0,2% ammoniakkvann eller mettet litiumkarbonatløsning i 30 sekunder til ett minutt. Vask deretter i rennende vann fra springen i fem minutter.
Motflekk med eosinløsning i 30 sekunder til ett minutt. Dehydrer gjennom 90% alkohol, deretter 95% alkohol, og absolutt alkohol i 0, 5 til to minutter hver. Etter dehydrering, klar i xylen i 30 sekunder.
Etter montering analyserer du H&E-fargingen ved hjelp av et brightfield fluorescensmikroskop. De røde blodlegemene som frigjøres fra blodårene, som er komponenter i CMHs, vises i rød-oransje under H&E farging. CmH-er på overflaten kan oppdages ved grov observasjon som angitt av de røde pilene.
Evans blå flekker avslører synlig rød fluorescens der Evans blå molekyler lekket fra en skadet blod-hjernebarriere. H&E farging viser røde blodlegemer funnet utenfor kapillærene, og prøyssisk farging avslører ferric ion poeng avledet fra lysis av røde blodlegemer. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at dosen av LPS for å indusere cerebral mikroblødning er større enn den som brukes i Parkinsons sykdom eller schizofreni modell.
Derfor bør miljøet av dyr holdes rent for å redusere dødeligheten. Etter denne prosedyren kan andre metoder som elektronmikroskopi, magnetisk resonansavbildning og immunofluorescent imaging utføres for å bestemme skaden på ytre struktur av blod-hjernebarrieren i cerebral mikroblødning, distribusjon av cerebral mikroblødning i hjerneparenchyma in vivo, samt glialcelleaktivering.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
