Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Co Иммунопреципитация Assay для изучения функционального взаимодействия между рецепторами и ферменты
Chapters
Summary September 28th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Здесь мы представляем собой протокол для co иммунопреципитация и ферментативную активность на шарик assay одновременно изучать вклад доменов конкретных протеина плазматической мембраны рецепторов фермента вербовки и активность фермента.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области сигнализации клеток, такие как важность различных белковых областей в взаимодействии ферментов рецепторов и ферментной активации. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет сопутствуя тестированию взаимодействия ферментов рецепторов и функциональных последствий этого взаимодействия на активность фермента. Для каждой пластины используйте 10 миллилитров DMEM, дополненных 10%FBS и 1%пенициллином и стрептомицином.
За день до трансфекции семенная эмбриональная почка человека 293-Т-клетки в 12 10-сантиметровых пластин с использованием гемоцитометра для подсчета клеток. Инкубация при 37 градусах по Цельсию в 5%C02. После того, как клетки от 80 до 90% стечения, использовать липид на основе трансфекции агента для трансфекции пять пластин.
Выполните трансфекцию в соответствии с инструкциями производителя по присоединению ячеек в 10-сантиметровых пластинах. Затем трансфект идентичный второй набор из пяти пластин вместе с одной дополнительной пластиной, выступающей в качестве нетрансфицированного контроля для измерения выраженного количества белка до иммунопреципиентации. Инкубировать трансфицированные пластины в инкубаторе культуры тканей при 37 градусах по Цельсию в 5%CO2 в течение 48 часов.
Используйте флуоресцентный микроскоп для изучения клеток для экспрессии GFP и обеспечения трансфекции успешно произошло. Смешайте 15 микролитров 100-миллимолярной ортованата натрия с 50 микролитров 30%перекиси водорода, чтобы подготовить свежую смесь перванадата. Для фосфорилировать помеченные версии PD-1, удалить средства массовой информации из PD-1-GFP трансфицированных клеток.
Добавьте 10 миллилитров простого DMEM и 10 микролитров перваната к каждой пластине. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого, мыть клетки три раза в ледяной PBS с помощью пяти миллилитров PBS за стирку.
При выполнении иммунопреципиентации все шаги должны выполняться либо на льду, либо при четырех градусах Цельсия. Дополнить буфер лиза ингибиторами протеазы, растворив одну таблетку ингибиторов в 10 миллилитров буфера. Кроме того, добавить один миллимоляр натрия ортованадат в буфер, который будет использоваться на PD-1-GFP-трансфицированных пластин.
Добавьте 500 микролитров ледяного буфера лиза в клетки, убедившись, что добавить буфер лиза, содержащий ортованата натрия только пластины, содержащие PD-1-GFP-трансфицированных клеток. Используйте сотовый скребок, чтобы немедленно удалить и собрать клетки из пластин. Перенесите лисаты в 1,5-миллилитровые холодные трубки и поверните их в 0,005 раза тяжести и при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут.
Чтобы собрать супернатант после ядра из ликатов, вращайте их вниз при 10 000 раз гравитации и четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Перенесите супернатанты в новые трубки и отбросьте гранулы. Храните супернатанты для второго набора из шести пластин на льду для более длительного анализа WCL.
Чтобы начать подготовку анти-GFP бусы, осторожно встряхните бутылку, содержащую бисер перед открытием, чтобы предотвратить урегулирование. Удалите 40 микролитров анти-GFP шарики из суспензии на каждое условие. Центрифуга при 500-времени гравитации и четыре градуса по Цельсию в течение трех минут.
Удалите супернатант для мытья бисера, убедившись, чтобы свести к минимуму контакт между пипеткой и бисером, чтобы предотвратить потерю. Перепродюсатор бисера в 80 микролитров буфера лиза на образец. Добавьте вымытые бусы непосредственно в лизат клетки из клеток PD-1-GFP-экспрессии первого набора из четырех пластин.
Поверните в 0,005 раза тяжести в течение 30 минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы иммунопреципилитировать GFP-тегами белков. Вымойте бисер три раза, используя один миллилитр холодного лиза буфера, который не содержит ортованата для каждого мытья. Затем центрифуга при 2500 раз больше гравитации в течение 10 секунд.
Разделите лизат активного SHP2 из первого набора пластин на три равные части и добавьте часть к каждой из трех трубок, содержащих промытые PD-1-GFP-содержащие бусы. Добавьте 1/3 объема лизита из нетрансфицированных клеток во вторую трубку дикого типа, PD-1-GFP шарики. Отбросьте оставшиеся 2/3.
Инкубировать бисер в течение четырех часов при четырех градусах по Цельсию с нежным вращением в 0,005 раза тяжести. После этого, мыть бисер в два раза с помощью одного миллилитра холодного лиза буфера для каждого мытья. Добавьте 80 микролитров буфера лиза в каждый образец, гарантируя, что общий объем в каждой трубке составляет 100 микролитров.
Используя наконечник пипетки, пипетку аккуратно вверх и вниз, чтобы смешать. Затем перенесите 50 микролитров из каждой трубки в две, свежие, 1,5 миллилитровые трубки. Вымойте бисер один раз с фосфатазы мыть буфер.
Затем удалите супернатант полностью. Добавьте 100 микролитров буфера анализа в бисер и инкубировать при 30 градусах по Цельсию в течение 30 минут под нежным возбуждением. Когда буфер желтеет, прекратите реакцию, добавив 50 микролитров одного молярного раствора гидроксида натрия.
Центрифуга при 2500 раз больше гравитации в течение 10 секунд. После этого перенесите супернатант на две скважины половины площади в пластине из 96 скважин. Прочитайте абсорбенты на 405 нанометров и выразить результаты, как относительная оптическая плотность над контролем дикого типа версии PD-1-GFP.
Первый спина вниз шарики на 2000 раз тяжести и четыре градуса по Цельсию в течение 30 секунд и удалить супернатант. Добавьте 20 микролитров в два раза буфер Laemmli и кипятить при 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Используя комплект BCA, измерьте концентрацию протеина управления входного сигнала.
Перенесите 30 микролитров наиболее разбавленного образца в новую трубку. Используйте буфер лиза, чтобы разбавить остальные элементы управления ввода до той же концентрации, что и наиболее разбавленный образец. Затем перенесите 30 микролитров каждого из разбавленных элементов управления ввода в новую трубку.
Добавить равные объемы в два раза Laemmli буфер лизирует и варить их 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. После этого, спина вниз бисера в 2000 раз тяжести и четыре градуса по Цельсию в течение 30 секунд, прежде чем выполнять анализ западной пятно, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании для параллельной оценки взаимодействий и активации рецепторов разработан комбинированный анализ ко-иммунопреципиентации и ферментной активности.
Неудивительно, что SHP2 не удалось связать с PD-1, когда ITSM мутировал. Примечательно, что мутантная версия ITIM препятствовала связыванию SHP2 лишь в ограниченной степени. Тем не менее, анализ активности SHP2-phosphatase показывает, что ITIM и ITSM одинаково незаменимы для энзиматической деятельности.
Это показывает двухшаговую модель активации, в которой SHP2 складывается в автоматическую конформацию в условиях покоя. После активации PD-1, SHP2 набирается в фосфорилированных ITSM. Тем не менее, ITIM также должны быть фосфорилированы, чтобы развернуть SHP2 в его активной конформации.
После его развития, этот метод может проложить путь для исследователей в области сигнализации клеток, чтобы исследовать функцию белковых доменов в рецепторно-ферментных взаимодействий.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
