阿尔茨海默病（AD）是一种导致老年患者认知功能下降的神经退行性疾病，主要由异常的β-淀粉样蛋白（Aβ）表达、聚集以及清除障碍引发，最终导致神经毒性¹^,²尽管Aβ聚集体与AD之间的关联已有充分表征³，但该疾病病理背后的精确机制尚未被充分阐明⁴越来越多的证据表明，神经血管功能障碍在阿尔茨海默病（AD）的进展和严重程度中起着重要作用。⁵，因为Aβ直接与循环系统的组分相互作用⁶Aβ 与纤维蛋白原具有高亲和力相互作用⁷^,⁸，该物质在阿尔茨海默病患者和小鼠模型的 Aβ 沉积中均有定位⁹^,¹⁰^,¹¹此外，Aβ与纤维蛋白原的相互作用会诱导异常的纤维蛋白凝块形成与结构改变，并导致对纤维蛋白溶解的抵抗性。⁹^,¹²一种治疗阿尔茨海默病的策略是通过抑制Aβ与纤维蛋白原之间的相互作用来改善循环系统缺陷¹³^,¹⁴因此，我们采用高通量筛选和药物化学方法，鉴定出若干可抑制Aβ与纤维蛋白原相互作用的小分子化合物。¹³^,¹⁴. 为检验 Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂的有效性，我们优化了两种用于分析的方案体外纤维蛋白凝块形成：凝块浊度检测与扫描电子显微镜（SEM）¹⁴.

凝块浊度检测是一种利用紫外-可见光谱法监测纤维蛋白凝块形成的简单且快速的方法。随着纤维蛋白凝块的形成，光散射逐渐增强，溶液的浊度也随之增加。相反，当存在Aβ时，纤维蛋白凝块的结构发生改变，混合物的浊度降低（图1）。可通过该方法评估抑制性化合物是否具有恢复Aβ引起的浊度异常的潜力。尽管浊度检测能够快速分析多种条件，但其对凝块的形态和结构提供的信息有限。扫描电子显微镜（SEM）利用电子束探测固体表面的形貌，可用于分析凝块的三维结构¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸，并评估Aβ和/或抑制性化合物的存在如何改变该结构⁹^,¹⁴。光谱法和SEM均为经典实验室技术，已被用于多种用途，例如，分光光度法可用于监测淀粉样蛋白的聚集过程¹⁹^,²⁰。同样，SEM也用于分析来自阿尔茨海默病、帕金森病和血栓栓塞性中风患者血浆所形成的纤维蛋白凝块²¹^,²²^,²³。本文所展示的实验方案经过优化，可重复且快速地评估纤维蛋白凝块的形成。

以下方案提供了制备一种体外纤维蛋白凝块（含Aβ与不含Aβ）的制备，并详细说明分析Aβ对纤维蛋白凝块形成及结构影响的方法。通过小分子抑制剂化合物TDI-2760，验证了这两种用于检测Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制效果的方法的有效性。¹⁴这些方法无论单独使用还是联合使用，均可实现对目标对象的快速且简便的分析体外纤维蛋白凝块形成。

基于微孔板的浊度检测方法的主要优势在于其快速高效，无需复杂的设备或条件，即可同时筛选多种淀粉样蛋白β-纤维蛋白原相互作用抑制剂。在纤维蛋白浊度检测中表现突出的候选化合物，可进一步通过扫描电子显微镜分析其是否能够恢复Aβ诱导的纤维蛋白凝块结构异常。制备用于扫描电子显微镜分析的凝块时，可视化操作演示至关重要，因为制备过程中的任何差异都可能导致实验结果的变异。

本演示的重点是 A-beta 与纤维蛋白原的相互作用。该方案可轻松修改用于分析其他蛋白质或化合物与纤维蛋白凝块的相互作用。首先，在每孔中加入 1.5 微摩尔的新鲜配制纤维蛋白原溶液（溶于 200 微升凝块形成缓冲液），分别加入含 A-beta 肽 42 和对照组的阴性孔中，然后将酶标板置于室温下的旋转平台上孵育。

30分钟后，将30微升新鲜配制的凝血酶溶液直接加入含纤维蛋白原的孔中央，以启动凝块形成，同时立即在350纳米波长下读取体外凝块的吸光度，并在接下来的10分钟内每30至60秒重复测量一次。为评估Aβ-纤维蛋白原相互作用抑制剂对纤维蛋白凝块结构的影响，首先用镊子将洁净的12毫米硅化玻璃圆盖玻片放入12孔板的各个孔中，然后在每张盖玻片上加入80微升纤维蛋白原溶液，轻轻铺展溶液使其均匀分布。随后在每个孔中加入20微升凝血酶溶液，以启动凝块形成。

将培养板盖好，在室温下孵育30至60分钟，然后用1毫升移液器小心地将每个凝块浸入2毫升冰冷的二甲胂酸钠缓冲液中，室温下覆盖孵育2分钟，重复洗涤两次，每次洗涤后用1毫升移液器小心吸除缓冲液。最后一次洗涤后，检查盖玻片上凝块的形成情况，并将凝块置于冰上，用2至3毫升冰冷的2%戊二醛固定30分钟。孵育结束后，轻轻吸去每孔中的戊二醛，随后如前所述在冰上用新鲜的二甲胂酸钠缓冲液洗涤凝块。

将固定的凝块在冰上用冰冻的乙醇以梯度方式洗涤，每次洗涤5分钟，洗涤过程中不要完全去除乙醇，以防止凝块暴露于空气中。在最后一次100%乙醇洗涤时，将盖玻片转移至临界点干燥仪的样品架中，每片盖玻片之间至少放置一个垫圈，并将样品架放入充满乙醇的临界点干燥室中。经过30分钟的干燥程序后，使用碳导电胶带将盖玻片分别固定在扫描电子显微镜样品台（stub）上，并将样品转移至真空溅射镀膜仪的溅射镀膜室中。

然后在样品上溅镀少于20纳米的金钯或其他导电材料，溅镀速率为每秒四埃，持续25秒，并在配备II型二次电子探测器的扫描电子显微镜上以4千伏电压对样品成像。纤维蛋白凝块的形成会导致透过溶液的光发生散射，从而引起浊度增加，并在读数期结束时达到平台期。当纤维蛋白原在A-beta 42存在下孵育时，溶液的浊度降低，其曲线达到的最大高度约为仅含纤维蛋白原时的一半。

在存在A-beta 42相互作用阻断剂的情况下，β-淀粉样蛋白的作用得到缓解，浊度高于仅存在A-beta时的情况。该阻断剂的作用并非源于背景浊度，因为在缺乏A-be

通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常