La enfermedad de Alzheimer (AD), una enfermedad neurodegenerativa que lleva a deterioro cognitivo en pacientes ancianos, predominantemente surge de la expresión anormal beta-amiloide (Aβ), agregación y separación deteriorada, dando lugar a neurotoxicidad¹^, ². a pesar de la Asociación bien caracterizada entre agregados de Aß y AD³, los mecanismos precisos subyacentes a la patología de la enfermedad no son bien entendidos⁴. Creciente evidencia sugiere que déficit neurovascular desempeñan un papel en la progresión y severidad de AD⁵, Aβ interactúa directamente con los componentes del sistema circulatorio⁶. Aβ tiene una interacción de alta afinidad con el fibrinógeno⁷^,⁸, que también se localiza a los depósitos Aβ en pacientes con EA y ratón modelos⁹^,¹⁰^,¹¹. Además, la interacción de fibrinógeno Aβ induce la formación anormal de coágulos de fibrina y estructura, así como resistencia a la fibrinolisis⁹^,¹². Una posibilidad terapéutica en el tratamiento de AD, es aliviar el déficit circulatorio mediante la inhibición de la interacción de Aß y fibrinógeno¹³^,¹⁴. Por lo tanto, identificamos varios pequeños compuestos inhiben la interacción de fibrinógeno Aβ con proyección de alto rendimiento y química medicinal enfoques¹³^,¹⁴. Para probar la eficacia de los inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aβ, hemos optimizado dos métodos para el análisis de en vitro la formación de coágulos de fibrina: coágulo turbidez análisis y exploración de la microscopia electrónica (SEM)¹⁴.

Análisis de turbidez de coágulo es un método sencillo y rápido para el seguimiento de la formación del coágulo de fibrina mediante espectroscopia UV-visible. Como el coágulo de fibrina se dispersa cada vez más formas, luz y aumenta la turbidez de la solución. Por el contrario, cuando Aß está presente, se altera la estructura del coágulo de fibrina, y se reduce la turbiedad de la mezcla (figura 1). El efecto de compuestos inhibitorios puede evaluarse el potencial restaurar coágulo turbidez de anormalidades inducidas por Aβ. Mientras que el análisis de turbidez permite un análisis rápido de varias condiciones, proporciona información limitada sobre el coágulo forma y estructura. SEM, en el que se revela la topografía de objetos sólidos por sonda de electrones, permite el análisis de la arquitectura 3D del coágulo¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ y la evaluación de cómo la presencia de Aß y compuestos inhibitorios y/o altera esa estructura⁹^,¹⁴. Tanto espectrometría y SEM son técnicas de laboratorio clásicas que se han utilizado para los varios propósitos, por ejemplo, espectrofotometría se utiliza para el control de la agregación amiloide¹⁹^,²⁰. Del mismo modo, SEM también se utiliza para analizar el coágulo de fibrina formado por el plasma de la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y accidente cerebrovascular tromboembólico pacientes²¹^,²²^,²³. Los protocolos aquí presentados están optimizados para evaluar la formación del coágulo de fibrina de forma rápida y reproducible.

El siguiente protocolo proporciona las instrucciones para la preparación de una en vitro -coágulo de fibrina con o sin Aβ. También detalla los métodos para analizar el efecto de Aß en la formación de coágulos de fibrina y estructura. La eficacia de estos dos métodos para medir la inhibición de la interacción de fibrinógeno Aβ se demuestra usando TDI-2760, un compuesto inhibitorio pequeño¹⁴. Estos métodos, tanto individualmente como en conjunto, permiten análisis rápido y sencillo de en vitro la formación de coágulos de fibrina.

Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido