מחלת אלצהיימר (AD), מחלת ניוון עצבי מוביל לירידה קוגניטיבית בחולים קשישים, יוכפל לאחר המרתו נובע חריג בטא עמילואיד (Aβ), צבירת וביטוי סיווג לקוי וכתוצאה מכך neurotoxicity1, 2. למרות האגודה מאופיין היטב בין Aβ אגרגטים לספירה3, המנגנונים מדויק המחלה פתולוגיה אינם מובנים היטב4. הוכחה גוברת מרמז כי הגירעונות נוירו-וסקולריים לשחק תפקיד התקדמות וחומרת של המודעה5, כפי Aβ ישירות אינטראקציה עם הרכיבים של מערכת הדם6. Aβ יש אינטראקציה גבוהה-זיקה עם פיברינוגן7,8, אשר רגישה גם על פיקדונות Aβ חולי אלצהיימר והן העכבר מודלים9,10,11. יתר על כן, האינטראקציה Aβ-פיברינוגן גורם היווצרות חריגה של clot פיברין, מבנה, כמו גם התנגדות ופיברינוליזה9,12. אפשרות טיפולית אחת בטיפול לספירה, היא שיכוך גירעונות הדם על ידי עיכוב האינטראקציה בין13,Aβ, פיברינוגן14. לכן, זיהינו מספר תרכובות קטן מעכבות את האינטראקציה Aβ-פיברינוגן באמצעות הקרנה תפוקה גבוהה וכימיה מרפא גישות13,14. כדי לבדוק את היעילות של מעכבי האינטראקציה Aβ-פיברינוגן, אנחנו ממוטב שתי שיטות לניתוח של במבחנה היווצרות קרישי פיברין: ייקרש עכירות assay וסריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)14.
קריש דם עכירות וזמינותו היא שיטה ישר קדימה ומהירה לניטור היווצרות קרישי פיברין באמצעות ספקטרוסקופית UV-גלוי. כמו קריש פיברין טפסים, תאורה מפוזרת יותר ויותר ומגביר עכירות של הפתרון. לעומת זאת, כאשר Aβ קיים, המבנה של קריש פיברין היא שונה, עכירות של התערובת מצטמצם (איור 1). יכול להיות שקובעת את ההשפעה של תרכובות מעכבות היכולת לשחזר עכירות קריש דם Aβ-induced הפרעות. בעוד וזמינותו עכירות מאפשר לניתוח מהיר של תנאים מרובים, הוא מספק מידע מוגבל על צורתו קריש דם. SEM, שבו לטופוגרפיה של חפצים מוצקים מתגלה על ידי אלקטרון הגישוש, מאפשר הניתוח של הארכיטקטורה תלת-ממד של17,18 16,15,קריש דם, את ההערכה של איך הנוכחות של Aβ, תרכובות מעכבות/או משנה את מבנה9,14. הן ספקטרומטר SEM הם וטכניקות מעבדה קלאסית כי שימשו למטרות שונות, לדוגמה, ספקטרופוטומטר משמש לניטור צבירת עמילואיד19,20. באופן דומה, SEM משמש גם כדי לנתח clot פיברין נוצר הפלזמה של אלצהיימר, פרקינסון, שבץ תרומבואמבוליים חולים21,22,23. הפרוטוקולים המובאים כאן הם אופטימיזציה עבור הערכת היווצרות קרישי פיברין בצורה מהירה הדירים.
פרוטוקול הבאים מספק את ההוראות להכנת במבחנה -clot פיברין עם ובלי Aβ. זה גם מפרט את שיטות כדי לנתח את השפעת Aβ על היווצרות קרישי פיברין ומבנה. היעילות של שתי השיטות למדידת עיכוב של האינטראקציה Aβ-פיברינוגן הוכח באמצעות TDI-2760, מתחם מעכבות14קטן. שיטות אלו, הן כיחידים והן יחד, מאפשרים ניתוח מהירה וישירה של במבחנה היווצרות קרישי פיברין.
היתרון העיקרי של זה צלחת מבוססי עגימות מבחן הוא שזה מהיר ומאפשר כמה מעכבי אינטראקציה עמילואיד-בטא פיברינוגן להיות מוקרן בבת אחת ללא התקנה מתוחכמת או דרישות. ניתן להעריך עוד יותר את תרכובות הראש נמצאות בבדיקה של עיסת פיברין על יכולתן לשחזר חריגות מבניות הנגרמות על-ידי A-beta בקרישי הפיברין שנותחו על-ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. הדגמה חזותית של הכנת קריש לסריקת ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים היא קריטית כמו כל וריאציות בהכנה יכול לתרום וריאציות בתוך התוצאות הניסוי.
המוקד של ההדגמה הזאת כאן הוא על אינטראקציות פיברינוגן A-בטא. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי לנתח אינטראקציות אחרות עם חלבונים אחרים ואת התרכובות עם קריש פיברין. התחל על ידי הוספת 1.5 micromolar של פיברינוגן מוכן טרי ב 200 microliters של חיץ היווצרות קריש לכל A-בטא שלילי 42 המכיל ולשלוט בארות דגירה את הצלחת על פלטפורמה מסתובבת בטמפרטורת החדר.
לאחר 30 דקות בו זמנית להוסיף 30 microliters של פתרון תרומבין מוכן טרי ישירות למרכז של היטב המכיל פיברינוגן ליזום היווצרות קריש ומיד לקרוא את הספיגה של קרישי במבחנה ב 350 ננומטר, חוזר על המדידה כל 30 עד 60 שניות במהלך 10 דקות. כדי להעריך את ההשפעה של מעכבי אינטראקציה פיברינוגן A-בטא על מבנה קריש פיברין, תחילה להשתמש במלקחיים כדי למקם נקי, 12 מילימטר סיליקון עיגול זכוכית מכסה מחליק ל בארות ב