アルツハイマー病 (AD)、高齢患者における認知機能の低下につながる神経変性疾患主に起こる異常な β アミロイド (a β) 式、集計および神経毒性¹^,の結果障害クリアランスから²。 a β の凝集体と広告³のよ特徴付けられた協会、にもかかわらず病の病理の基礎となる正確なメカニズムの理解⁴ではありません。証拠が増えている神経血管障害が進行と広告⁵の重症度の役割を果たすこと a β は直接循環システム⁶のコンポーネントと対話します。A β フィブリノーゲン⁷^、は⁸、AD 患者でマウスモデル⁹^,¹⁰^,¹¹a β 預金も鈍痛と高親和性の相互作用があります。さらに、線溶⁹^,¹²への抵抗と同様、異常なフィブリン血栓形成と構造、a β フィブリノーゲンの相互作用を誘導します。循環障害、a β とフィブリノゲン¹³^,¹⁴間の相互作用を阻害することによって広告の治療 1 つの治療可能性を軽減すること。我々は、したがって、高スループットスクリーニングと医薬品化学アプローチ¹³^,¹⁴a β フィブリノーゲンの相互作用を阻害するいくつかの小さな化合物を識別されます。A β フィブリノーゲン相互作用阻害剤の有効性をテストするためフィブリン血栓形成の in vitro解析の 2 つの方法を最適化: 濁度分析、走査電子顕微鏡 (SEM)¹⁴を凝固します。

血栓濁度測定は、紫外可視分光法を用いたフィブリン血栓形成を監視するための単純明快かつ迅速な方法です。フォーム、光はますますフィブリン血栓として散らばっているし、ソリューションの濁度を増加させます。逆に、a β が存在する場合フィブリン血栓の構造を変更すると、および混合物の濁度が減少 (図 1)。A β による異常から血栓の濁度を復元する潜在的な阻害物質の影響を評価できます。濁度測定は、複数の条件の迅速分析できますが、塊形状と構造に関する限定的な情報を提供します。血栓¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ 3 D アーキテクチャの方法の評価分析を SEM では、電子プローブによってソリッドオブジェクトの形状が明らかになる可能 a β の存在とあるいは阻害化合物は、その構造⁹^,¹⁴を変更します。両方の様々な目的のために使用されている古典的な実験技術は、SEM 分析法、吸光光度法をアミロイド凝集¹⁹^,²⁰を監視に使用するたとえば。同様に、SEM は、またパーキンソン病や血栓塞栓性脳卒中患者²¹^,²²^,²³アルツハイマー病のプラズマから形成されるフィブリン血栓を分析する使用されます。ここに示すプロトコルは、再現性と迅速な方法でフィブリン血栓形成の評価に最適です。

次のプロトコルは、体外フィブリン-血栓と a β なしの準備のための手順を提供します。また、フィブリン血栓形成と構造の a β の効果を分析する方法の詳細します。TDI-2760、小さな阻害化合物¹⁴を使用して a β フィブリノーゲンの相互作用の阻害を測定するためのこれらの 2 つの方法の有効性を示します。これらのメソッドを個別と一緒はフィブリン血栓形成の in vitroの迅速かつ簡単ですが解析できるように。

このプレートベースの濁度アッセイの主な利点は、迅速であり、洗練されたセットアップや要件なしに一度にスクリーニングされるいくつかのアミロイド-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤を可能にすることです。フィブリン濁度アッセイにあるヘッド化合物は、走査型電子顕微鏡法で分析したフィブリン血栓中のA-β誘発構造異常を回復させる能力についてさらに評価することができる。スキャン電子顕微鏡分析のための血栓調製の視覚的実証は、製剤の変動が実験結果内の変動に寄与する可能性があるため、極めて重要である。

ここでのデモの焦点は、A-ベータフィブリノーゲン相互作用です。このプロトコルは、他のタンパク質およびフィブリン凝固物との化合物との他の相互作用を分析するために容易に変更することができる。まず、200マイクロリットルの血栓形成バッファーに1.5マイクロモルの血栓形成バッファーを含み、制御ウェルを含み、室温で回転プラットフォーム上でプレートをインキュベートします。

30分後に同時に30マイクロリットルの新しく調製したトロンビン溶液をフィブリノーゲン含有ウェルの中央に直接加えて血栓形成を開始し、350ナノメートルでインビトロ凝固の吸光度を直ちに読み取り、10分間にわたって30〜60秒ごとに測定を繰り返します。フィブリン血栓構造に対するA-βフィブリノーゲン相互作用阻害剤の効果を評価するために、最初に鉗子を使用して清潔に置き、12ミリメートルのシリコン化ガラスサークルカバーが12ウェルプレートの個々の井戸に滑り込み、各カバースリップに80マイクロリットルのフィブリノーゲンを加え、溶液を均等に広げます。血栓形成を開始するために各ウェルにトロンビン溶液の20マイクロリットルを追加します。

プレートを室温で30〜60分間インキュベーションし、各血栓を2ミリリットルの氷冷ナトリウムカコチル酸緩衝液に2分間静かに浸し、室温で2回、1ミリリットルのピペットを使用して洗浄後に慎重にバッファーを取り除きます。最後の洗浄後、カバースリップの血栓形成の状態を確認し、氷冷2%グルタルアルデヒドを氷上で2〜3ミリリットルに30分間固定します。インキュベーションの終わりに、各ウェルからグルタルアルデヒドを静かに取り出し、氷上で実証したように新鮮なカコチル酸ナトリウム緩衝液で血栓を洗います。

空気暴露から保護された血栓を維持するために、水の間のエタノールを完全に除去することなく氷上で5分間の氷冷エタノールの水を通して固定された血栓を水和する。最後の100%エタノール洗浄中に、カバースリップを臨界点乾燥機のサンプルホルダーに移し、各カバースリップの間に少なくとも1つの洗濯機を入れ、ホルダーをエタノールで満たされた臨界点乾燥機室に入れます。30分の乾燥サイクルの後、カーボンテープを使用してカバースリップを個々の走査型電子顕微鏡スタ

Β アミロイド誘起分光と電子顕微鏡によるフィブリン血栓構造異常の解析