Alzheimer의 질병 (광고), 신경 질환 노인 환자에서 인지 감소에 이어지는 주로 비정상적인 베타-아 밀 로이드 (Aβ) 식, 집계 및 장애인된 클리어런스 neurotoxicity¹^, 의 결과에서 발생 ². Aβ 집계 및 광고³사이 잘 특징이 협회에도 불구 하 고 근본적인 질병 병 리 정확한 메커니즘은 잘 이해⁴. 증거를 증가 제안 Aβ⁶순환 시스템 구성 요소와 직접 상호 작용으로 neurovascular 적자 진행 및 광고⁵, 심각도에 역할을 재생 합니다. Aβ는 fibrinogen⁷^,⁸, 또한 광고 환자 및 마우스 모델⁹^,^,¹⁰¹¹Aβ 예금 localizes와 높은 선호도 상호 작용. 또한, Aβ fibrinogen 상호 작용 fibrinolysis⁹^,¹²저항 뿐만 아니라 비정상적인 섬유 소 혈전 형성 및 구조, 유도합니다. 광고, 치료 한 치료 가능성 Aβ 및 fibrinogen¹³^,¹⁴사이 상호 작용을 억제 함으로써 순환 적자 경감 이다. 우리는, 그러므로, 높은 처리량 검열 및의 약 화학 접근¹³^,¹⁴를 사용 하 여 Aβ fibrinogen 상호 작용을 억제 하는 여러 작은 화합물 확인. Aβ-fibrinogen 상호 작용 억제제의 효능을 테스트 하려면 우리 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 분석을 위한 두 가지 방법을 최적화: 응고 탁도 분석 결과 및 스캐닝 전자 현미경 (SEM)¹⁴.

병 탁도 분석 결과 섬유 소 혈전 형성 UV 보이는 분광학을 사용 하 여 모니터링을 위한 스트레이트-앞으로 및 빠른 방법입니다. 섬유 소 혈전으로 형태, 빛은 점점 더 흩어져 하 고 솔루션의 탁도 증가 한다. 반대로, Aβ 있으면, 섬유 소 혈전의 구조 변경 및 혼합물의 탁도 감소 된다 (그림 1). 억제 화합물의 효과 병 탁 Aβ 유도 이상에서 복원 가능성에 대 한 평가 될 수 있습니다. 탁도 분석 결과 여러 조건의 신속한 분석에 대 한 수 있으며, 병 모양 및 구조에 제한 된 정보를 제공 합니다. SEM, 솔리드 객체의 지형 전자 조사에 의해 밝혀 수 응고¹⁵^,¹⁶^,^,¹⁷¹⁸ 의 3 차원 구조 분석 방법의 평가 대 한 Aβ의 존재와 또는 억제 화합물 그 구조⁹^,¹⁴변경 합니다. 두 분석 및 SEM는 다양 한 목적을 위해 사용 된 고전적인 실험실 기술, 예, 분 광 광도 법 녹말 체 집계¹⁹^,²⁰모니터링을 위해 사용 됩니다. 마찬가지로, SEM 분석 파 킨 슨 병 및 thromboembolic 치기 환자²¹^,^,²²²³Alzheimer, 플라즈마에서 형성 된 섬유 소 병 하도 사용 됩니다. 여기에 제시 된 프로토콜은 재현 하 고 빠른 방식으로 섬유 소 혈전 형성 평가 적합 합니다.

다음 프로토콜 생체 외에서 섬유 소-응고를 모두와 함께 Aβ 없이 준비에 대 한 지침을 제공합니다. 그것은 또한 섬유 소 혈전 형성과 구조에 Aβ의 효과 분석 하는 방법을 자세히 설명 합니다. Aβ-fibrinogen 상호 작용의 억제를 측정 하기 위한이 두 가지 방법의 효과 TDI-2760, 작은 억제 화합물¹⁴를 사용 하 여 보여 줍니다. 이 방법을 개별적으로 함께, 섬유 소 혈전 형성 체 외에서 의 신속 하 고 간단 분석 허용.

이 플레이트 기반 탁도 분석의 주요 장점은 빠르며 정교한 설정이나 요구 사항없이 여러 아밀로이드 베타 피브리노겐 상호 작용 억제제를 한 번에 선별 할 수 있다는 것입니다. 피브린 탁도 분석에 있는 헤드 화합물은 전자 현미경 검사를 스캔하여 분석된 피브린 혈전에서 A-베타 유도 된 구조적 이상을 복원하는 능력에 대해 더욱 평가될 수 있다. 전자 현미경 분석을 스캔하기 위한 혈전 제제의 시각적 데모는 제제의 모든 변화가 실험 결과 내의 변화에 기여할 수 있기 때문에 매우 중요합니다.

이 데모의 초점은 A-베타 피브리노겐 상호 작용에 있습니다. 이 프로토콜은 다른 단백질및 피브린 응고와의 화합물과의 다른 상호 작용을 분석하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 먼저 200마이크로리터의 응고 형성 버퍼에 갓 준비된 피브리노겐 1.5 마이크로몰라를 각 A-베타 네거티브(42)에 첨가하여 우물을 포함하고 제어하고 실온에서 회전 플랫폼에서 플레이트를 배양한다.

30분 후, 30분 동안 새로 준비된 트롬빈 용액 30마이크로리터를 피브리노겐 함유 의 중앙에 직접 추가하여 혈전 형성을 시작하고 즉시 350나노미터에서 체외 혈전의 흡수를 판독하여 10분 동안 30~60초마다 측정을 반복합니다. 피브린 응고 구조에 대한 A-베타 피브리노겐 상호 작용 억제제의 효과를 평가하기 위해 먼저 집게를 사용하여 12웰 플레이트의 개별 우물에 12mm 실리콘 유리 원 덮개 를 넣고 80 마이크로리터의 피브리노겐을 각 커버 슬립에 부드럽게 추가하여 용액을 균등하게 분산시합니다. 혈전 형성을 시작하기 위해 각 웰에 20 마이크로리터의 혈전 용액을 추가합니다.

실온에서 30~60분 동안 배양한 다음, 각 응고를 2밀리리터의 얼음냉나트륨 소염 버퍼에 2밀리리터로 부드럽게 담근 다음, 실온에서 두 번, 1밀리리터 파이펫을 사용하여 각 세척 후 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 마지막 세척 후, 커버 슬립에 응고 형성의 상태를 확인하고 30 분 동안 얼음에 얼음 차가운 2 % 글루타랄데히드의 2 ~ 3 밀리리터에 혈전을 수정합니다. 인큐베이션이 끝나면 각 우물에서 글루타랄데히드를 부드럽게 제거하고 얼음위에서 보여준 것처럼 신선한 나트륨 캐코디레이트 버퍼로 혈전을 씻습니다.

공기 노출로부터 응고를 보호하기 위해 워시 사이에 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음 에탄올을 완전히 제거하지 않고 얼음에 5분 짜리 얼음 차가운 에탄올 의 등급 시리즈에서 고정 된 혈전을 수화한다. 마

분광학 그리고 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 섬유 소 혈전 구조에 β 아 밀 로이드 유도 비정상의 분석