De ziekte van Alzheimer (AD), een neurodegeneratieve ziekte leidt tot cognitieve achteruitgang bij oudere patienten, voornamelijk voortkomt uit abnormale amyloid-bèta (Aβ) expressie, aggregatie en verminderde klaring resulterend in neurotoxiciteit¹^, ². ondanks de goed gekarakteriseerd associatie tussen Aβ aggregaten en AD³, zijn de precieze mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologie ziekte niet goed begrepen⁴. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat neurovasculaire tekorten een rol bij de progressie en de ernst van AD^{5 spelen}, zoals Aβ rechtstreeks met de componenten van de bloedsomloop^{6 communiceert}. Aβ heeft een hoge-affiniteit interactie met fibrinogeen⁷^,⁸, die ook Aβ deposito's in zowel AD patiënten en muis modellen⁹^,¹⁰^,^{11 lokaliseert}. Bovendien is de interactie Aβ-fibrinogeen induceert abnormale fibrine-clot formatie en structuur, evenals de weerstand tegen Fibrinolyse⁹^,¹². Een van de therapeutische mogelijkheden bij de behandeling van AD, is het verlichten van bloedsomloop tekorten door remming van de interactie tussen Aβ en fibrinogeen¹³^,¹⁴. Wij, geïdentificeerd daarom diverse kleine verbindingen remming van de Aβ-fibrinogeen interactie met behulp van hoge-doorvoer screening en medicinale chemie benaderingen¹³^,¹⁴. Om te testen van de werkzaamheid van Aβ-fibrinogeen interactie remmers, geoptimaliseerd we twee methoden voor de analyse van in vitro fibrine clot vorming: stollen troebelheid assay en scanning elektronen microscopie (SEM),¹⁴.

Clot troebelheid assay is een rechttoe-rechtaan en snelle methode voor de controle van fibrine clot vorming met behulp van UV-zichtbaar spectroscopie. Als de fibrine clot formulieren, licht is steeds meer verspreid en de troebelheid van de oplossing verhoogt. Omgekeerd, wanneer Aβ aanwezig is, de structuur van het fibrine clot wordt gewijzigd, en de troebelheid van het mengsel wordt verminderd (Figuur 1). Het effect van remmende stoffen kan worden beoordeeld voor de mogelijkheden waaruit u wilt terugzetten clot troebelheid Aβ-geïnduceerde afwijkingen. Terwijl de troebelheid assay voor snelle analyse van meerdere voorwaarden zorgt, biedt het beperkte informatie over de klonter vorm en structuur. SEM, waarin de topografie voor massieve voorwerpen is geopenbaard door elektron sonde, zorgt voor de analyse van de 3D-architectuur van de klonter¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸ en de beoordeling van hoe de aanwezigheid van Aβ en / of inhiberende verbindingen verandert die structuur⁹^,¹⁴. Beide spectrometrie en SEM zijn klassieke laboratoriumtechnieken die zijn gebruikt voor verschillende doeleinden, bijvoorbeeld spectrofotometrie wordt gebruikt voor de controle van amyloïde aggregatie¹⁹^,²⁰. Evenzo, SEM wordt ook gebruikt voor het analyseren van fibrine clot gevormd uit het plasma van de ziekte van Alzheimer, Parkinson en trombo-embolische beroerte patiënten²¹^,²²^,²³. De protocollen die hier gepresenteerd worden geoptimaliseerd voor de beoordeling van de vorming van fibrine-clot reproduceerbaar en snelle wijze.

Het volgende protocol bevat de instructies voor de voorbereiding van een in vitro fibrine-clot zowel met als zonder Aβ. Het ook een overzicht van de methoden voor het analyseren van het effect van Aβ op fibrine clot formatie en structuur. De effectiviteit van deze twee methoden voor het meten van de remming van de Aβ-fibrinogeen interactie is aangetoond door middel van TDI-2760, een kleine remmende samengestelde¹⁴. Deze methoden, toestaan zowel individueel als samen voor snelle en eenvoudige analyse van in vitro fibrine clot vorming.

Analyse van β-Amyloid-geïnduceerde afwijkingen op fibrine Clot structuur door spectroscopie en Scanning elektronen microscopie