A doença de Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa, levando ao declínio cognitivo em pacientes idosos, predominantemente decorre anormal expressão de beta-amiloide (Aβ), agregação e liberação prejudicada, resultando em neurotoxicidade¹^, ². apesar da associação bem caracterizada entre agregados Aβ e AD³, os mecanismos precisos subjacentes a patologia da doença não são bem compreendidas⁴. Aumentando a evidência sugere que os défices neurovascular desempenham um papel na progressão e gravidade da AD⁵, como Aβ interage diretamente com os componentes do sistema circulatório⁶. Aβ tem uma interação de alta afinidade com fibrinogênio⁷^,⁸, que localiza também aos depósitos Aβ em pacientes AD e rato modelos⁹^,¹⁰^,¹¹. Além disso, a interação de Aβ-fibrinogênio induz a formação do coágulo de fibrina anormal e estrutura, bem como resistência a fibrinólise⁹^,¹². Uma possibilidade terapêutica no tratamento de AD, está aliviando o déficit circulatório, inibindo a interação entre Aβ e fibrinogênio¹³^,¹⁴. Nós, portanto, identificamos vários pequenos compostos, inibindo a interação de Aβ-fibrinogênio usando alto throughput triagem e química medicinal abordagens¹³^,¹⁴. Para testar a eficácia de inibidores de interação Aβ-fibrinogênio, nós aperfeiçoamos a dois métodos de análise de em vitro formação de coágulos de fibrina: coagular ensaio de turbidez e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)¹⁴.

Ensaio de turbidez de coágulo é um método direto e rápido para monitorar a formação de coágulos de fibrina usando espectroscopia UV-visível. Como o coágulo de fibrina, formas, luz é cada vez mais dispersos e a turbidez da solução aumenta. Inversamente, quando Aβ está presente, a estrutura do coágulo de fibrina é alterada, e a turvação da mistura é reduzida (Figura 1). O efeito inibitório compostos pode ser avaliado para o potencial de restaurar o coágulo turbidez de anormalidades Aβ-induzida. Enquanto o ensaio de turbidez permite análise rápida de várias condições, fornece informações limitadas sobre a forma de coágulo e estrutura. SEM, em que a topografia de objetos sólidos é revelada pela sonda de elétron, permite a análise da arquitetura 3D do coágulo¹⁶^,¹⁵^,¹⁷^,¹⁸ e a avaliação de como a presença de Aβ e / ou compostos inibitórios altera essa estrutura⁹^,¹⁴. Tanto espectrometria e SEM são técnicas clássicas de laboratório que foram usadas para diversos fins, por exemplo, espectrofotometria usada para monitorar a agregação amiloide¹⁹^,²⁰. Da mesma forma, SEM também é usado para analisar o coágulo de fibrina formado a partir do plasma do Alzheimer, Parkinson e AVC tromboembólico pacientes²¹^,²²^,²³. Os protocolos aqui apresentados são otimizados para avaliar a formação do coágulo de fibrina de forma rápida e reprodutível.

O protocolo seguinte fornece as instruções para a preparação de um em vitro -coágulo de fibrina com e sem Aβ. Ele também detalha os métodos para analisar o efeito de Aβ na formação do coágulo de fibrina e estrutura. A eficácia destes dois métodos para medir a inibição da interação Aβ-fibrinogênio é demonstrada usando TDI-2760, um pequeno compostos inibitórios¹⁴. Esses métodos, tanto individualmente e em conjunto, permitem uma análise rápida e simples de em vitro formação de coágulos de fibrina.

Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica