Анализ отклонений β-амилоид индуцированной фибринового сгустка структуры спектроскопии и растровая электронная микроскопия

Болезнь Альцгеймера (AD), нейродегенеративных заболеваний, ведущих к когнитивным снижением пожилых пациентов, преимущественно возникает из ненормальное бета амилоида (значения) выражение, агрегирование и нарушением Распродажа результате нейротоксичность^{1, 2}. Несмотря на хорошо изученных связь между значения агрегатов и объявление³, точные механизмы, лежащие в основе заболевания патология не являются хорошо понимали⁴. Все больше фактов предполагает нервно-сосудистого дефицита играть роль в прогрессии и тяжести AD⁵, как значения непосредственно взаимодействует с компонентами системы кровообращения⁶. Значения есть высокоспецифичных взаимодействие с фибриноген^7,8, который также локализует значения вкладов в AD пациентов и мыши модели^9,10,11. Кроме того значения фибриноген взаимодействия вызывает аномальные фибрин-сгустков и структура, а также сопротивление фибринолиза^9,12. Один терапевтические возможности в лечении AD, облегчение кровообращения дефицита путем ингибирования взаимодействие между Aβ и фибриногена^13,14. Мы, таким образом, определены несколько небольших соединений, ингибирующих значения фибриноген взаимодействия с помощью скрининга высокую пропускную способность и фармацевтическая химия подходы^13,14. Чтобы проверить эффективность ингибиторов фибриноген значения взаимодействия, мы оптимизировали два метода для анализа в vitro сгустков фибрина: сгусток мутность пробирного и сканирование электронная микроскопия (SEM)¹⁴.

Сгусток мутность пробирного является прямой и быстрый метод для мониторинга сгустков фибрина с помощью УФ видимые спектроскопии. Как сгусток фибрина чаще рассеивается формы, света и помутнение раствора увеличивается. И наоборот, когда значения присутствует, изменяется структура фибринового сгустка, и помутнения смеси снижается (рис. 1). Эффект ингибирующее соединений можно оценить потенциал для восстановления сгусток мутности от значения индуцированной аномалии. Хотя мутность assay позволяет для быстрого анализа нескольких условий, предоставляет ограниченные сведения о сгусток формы и структуры. SEM, в котором топографии твердых объектов раскрывается зондом электрона, позволяет для анализа 3D архитектура сгусток^15,16,17,18 и оценки как наличие значения и ингибирующее соединений или изменяет что структура^9,14. Оба-спектрометрии и SEM классических лабораторных методов, используемых для различных целей, например, спектрофотометрия используется для мониторинга амилоида агрегации^19,20. Аналогичным образом SEM также используется для анализа фибринового сгустка, образуются из плазмы Альцгеймера, Паркинсона и тромбоэмболических инсульт пациентов^21,,22-²³. Здесь представлены протоколы оптимизированы для оценки сгустков фибрина воспроизводимость и быстрым образом.

Следующий протокол содержит инструкции для подготовки в vitro фибрин сгусток с и без значения. В нем также подробно методы для анализа влияния значения на сгустков фибрина и структуры. Эффективность этих двух методов для измерения ингибирование значения фибриноген взаимодействия подтверждается с помощью TDI-2760, небольшой тормозящий составные¹⁴. Эти методы, как индивидуально, так и вместе, позволяют для быстрой и простой анализ формирования в vitro фибринового сгустка.