Immunology and Infection
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संक्रामक Bursal रोग वायरस का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व Vivo चिकन प्राथमिक Bursal-सेल संस्कृति मॉडल रोगजनन
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यहाँ हम Fabricius के बर्सा से चिकन प्राथमिक bursal कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन, संस्कृति और संक्रामक bursal रोग वायरस के साथ कोशिकाओं के संक्रमण, और वायरल प्रतिकृति के ठहराव.
Transcript
यह विधि एवियन वायरोलॉजी क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे कि इम्यूनोसप्रेसिव वायरस बी कोशिकाओं के साथ कैसे बातचीत करते हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि कोशिकाएं वर्तमान में प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली अमर कोशिका लाइनों की तुलना में अधिक प्रासंगिक हैं। हालांकि इस विधि कैसे चिकन कोशिकाओं IBDV का जवाब में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, यह भी ALV और REV के लिए लागू किया जा सकता है ।
यह विधि हमारे शोध में पक्षियों की संख्या को कम करती है, और यह तीन रुपये के लिए फायदेमंद है, जो अनुसंधान में पशु के उपयोग के प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के लिए खड़ा है । माइक्रोबायोलॉजिकल सेफ्टी कैबिनेट में बीएफ को 30 मिलीलीटर ठंडे पीबीएस में कम से तीन बार धोएं । धुले हुए ऊतक को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और 1X कोलेजन डी समाधान के पांच मिलीलीटर जोड़ें।
BF को उन टुकड़ों में काटने के लिए बाँझ कैंची या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें जो व्यास में पांच मिलीमीटर से कम हैं। 30 मिनट तक आवधिक कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। इसके बाद, ऊतक के विघटन को प्रोत्साहित करने के लिए मिश्रण को बार-बार एस्पिरेट करने के लिए बाँझ पाश्चुर पिपेट का उपयोग करें।
ऊतक के लिए 1X कोलेजनेस डी समाधान के एक और पांच मिलीलीटर जोड़ें, और इसे एक और 30 मिनट के लिए आवधिक कोमल आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इस प्रक्रिया को दोहराएं, मिश्रण को एस्पिरेशन करें, ताजा कोलेजनस डी समाधान जोड़ें, और तब तक इनक्यूबेटिंग करें जब तक कि ऊतक पूरी तरह से पच न जाए। ध्यान रहे कि छोटे कणिकाएं होंगी जो आगे घुलेंगे नहीं।
कैल्शियम के बिना 1X एचबीबीएस के 20 मिलीलीटर में 100-माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से पचाए गए सेल निलंबन को पास करें। पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर सेंट्रलाइज। सुपरनैट को त्यागें, 5% एफबीएस के साथ 1X आरपीएमआई के 10 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।
फिर, घनत्व ढाल मीडिया के पांच मिलीलीटर के शीर्ष पर सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर ओवरले जिसमें पॉलीसक्रोज और सोडियम डायट्रिज़ोएट होता है। सुनिश्चित करें कि दो परतों के बीच एक स्पष्ट इंटरफ़ेस है। 900 बार जी और 20 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज।
कोशिकाओं को सेल मीडिया और घनत्व ढाल मीडिया के बीच इंटरफेस पर एक बैंड बनाना चाहिए। इसके बाद, कोशिकाओं को हटाने और उन्हें ठंडे पीबीएस युक्त ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ पाश्चुर पिपेट का उपयोग करें। कोशिकाओं को पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर अपकेंद्री करके धोएं और फिर उन्हें ठंडे पीबीएस में फिर से खर्च करें।
इस वॉश को तीन बार दोहराएं। सबसे पहले, पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। 1X पूर्ण आईएमडीएम के 30 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
सेल निलंबन का एक एलिकोट लें, और इसे ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन में जोड़ें। ट्राइपैन ब्लू को बाहर करने वाली व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनें, और कोशिकाओं की संख्या और प्रतिशत व्यवहार्यता निर्धारित करें। इसके बाद, पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र करें।
पूर्ण आईएमडीएम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें चिकन सीडी 40 लिगंड के एक-से-20 कमजोर पड़ने के साथ प्रति मिलीलीटर 10 मिलियन कोशिकाओं के घनत्व पर। संस्कृति या तो ९६ में कोशिकाओं-या 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए ४८ से ७२ घंटे के लिए । 48 से 72 घंटे के बाद अलगाव, वायरस का एक aliquot गल.
भंवर नमूना है, और यह बर्फ पर स्टोर। आईएमडीएम माध्यम में प्राथमिक बर्सल कोशिकाओं को फिर से रीसपेंड करें। सेल सस्पेंशन का 10 माइक्रोलीटर एलिकोट लें, और इसे ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन के 10 माइक्रोलीटर में जोड़ें।
फिर, कोशिकाओं की संख्या और प्रतिशत व्यवहार्यता निर्धारित करें। वायरस को इनोकुलम बनाने के लिए संक्रमण की उचित बहुलता के लिए 1X पूर्ण आईएमडीएम में वायरस को पतला करें। इस कमजोर पड़ने को भंवर से मिलाएं।
पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। इसके बाद, सुपरनैंट को हटा दें, और वायरस इनोकुलम में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। आवधिक आंदोलन के साथ एक घंटे तक 37 डिग्री सेल्सियस पर।
इसके बाद, पांच मिनट के लिए 400 बार जी पर सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र करें। वायरस इनोकुलम निकालें, और 1X पूरा IMDM मीडिया में कोशिकाओं को धो । संस्कृति या तो ९६ में कोशिकाओं-या 24 अच्छी तरह से प्लेटें ।
इस अध्ययन में, चिकन प्राथमिक बर्सल कोशिकाओं को घुलनशील चिकन सीडी 40 लिगामेंट की उपस्थिति में क्रमिक रूप से सुसंस्कृत पूर्व वीवो किया जाता है। घुलनशील चिकन CD40 ligand की उपस्थिति में सुसंस्कृत कोशिकाओं को छह दिनों की अवधि में ९०२, 000 से ३,६३०,० प्रति मिलीलीटर से चार गुना वृद्धि करने के लिए देखा जाता है । चिकन सीडी 40 लिगामेंट की उपस्थिति में सेल व्यवहार्यता में भी काफी सुधार हुआ है।
प्रतिनिधि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी छवियों में, संक्रमित कोशिकाओं को नाभिक के चारों ओर एक हरे रंग की फ्लोरेसेंस देखा जाता है, जो साइटोप्लाज्म में आईबीडीवी की उपस्थिति के अनुरूप है। यह IBDV के दो उपभेदों के लिए स्पष्ट है, एक सेल संस्कृति अनुकूलित तनाव, D78, और एक बहुत ही उग्र तनाव, UK661। आरएनए तो पांच, 18, 24, और ४८ घंटे के बाद संक्रमण पर निकाला है और IBDV VP4 जीन के एक संरक्षित क्षेत्र के लिए विशिष्ट प्राइमर के साथ आरटी-qPCR के अधीन है ।
IBDV VP4 अभिव्यक्ति D78 के साथ संक्रमण के बाद 48 घंटे में 16, 603 प्रतियों को बढ़ाने के लिए और UK661 के साथ 48 घंटे के बाद 38, 632 प्रतियां करने के लिए देखा जाता है। यह डेटा दर्शाता है कि चिकन प्राथमिक बर्सल कोशिकाएं सेल-कल्चर-अनुकूलित और बहुत उग्र IBDV उपभेदों की प्रतिकृति का समर्थन कर सकती हैं। इस प्रक्रिया के बाद, अतिरिक्त प्रश्नों का उत्तर देने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर, माइक्रोएरे, या आरएनए-सेक्यू जैसे अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है, जैसे कि कोशिकाएं संक्रमण का जवाब कैसे देती हैं।
हमने तुलना की है कि कोशिकाएं एक तनु तनाव और IBDV के एक बहुत ही उग्र तनाव के साथ संक्रमण का जवाब कैसे देती हैं और हमारी अब जांच कैसे वे अन्य वायरल संक्रमणों का जवाब देते हैं। इन कोशिकाओं को संस्कृति की क्षमता हमें पक्षियों को संक्रमित करने की आवश्यकता के बिना वायरस रोगजनन और इम्यूनोसप्रेसेशन के पहलुओं का अध्ययन करने की अनुमति देती है। इससे शोध में जानवरों के प्रतिस्थापन, शोधन और उनके उपयोग में कमी का खासा असर पड़ेगा।
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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १४० चिकन प्राइमरी सेल बर्सा ऑफ Fabricius बी सेल वायरस संक्रामक bursal डिजीज वायरस IBDVRelated Videos
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