Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
High-throughput meting van darm transittijd met behulp van larvale zebravis
Chapters
Summary October 23rd, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het doel van dit protocol is voor het meten van de transittijd van fluorescently geëtiketteerde voedsel door de darm van larvale zebrafish in een hoge doorvoersnelheid mode.
Transcript
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot gastro-intestinale biologie, zoals hoe veranderingen in genexpressie of milieu-uitdagingen de darmfunctie veranderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het minder tijd kost en gemakkelijker uit te voeren is dan traditionele methoden voor het meten van darmdoorvoer. Op de dag van de test worden larven gevoed met voedsel met een fluorescerend etiket, en als ze dat voedsel eten, zal het etiket zich ophopen in hun darmen.
Na het voeden worden ze gespoeld, gescheiden van niet-opgegeten voedsel en wordt elke larve overgebracht naar een put van een meerputtend bord. De put heeft een kegelvormige bodem, zodat wanneer fecale materie wordt ongeldig verklaard, het valt in het midden van de put. Vergeet niet dat er veel larven in de multi-well plaat zitten die gelijktijdig kunnen worden gecontroleerd met behulp van een plaatspectrofotometer, die de hoeveelheid vervallen fecale materie meet.
En naarmate er meer in de loop van de tijd wordt ongeldig verklaard, neemt het signaal dienovereenkomstig toe. Op deze manier hebben we een hoge doorvoermethode voor het meten van darmdoorvoer. Op de vierde dag na de bevruchting, strooi twee milligram poedervorm larve vis voedsel op de top van het water in elke petrischaal om de larven te voeden.
Laat de larven vier uur te voeden. Breng na het voeden alle larven over op een grote spoelschaal met vers embryomedium. Met behulp van een 50 milliliter serologische pipet, voorzichtig vacuüm zo veel van de overgebleven voedsel mogelijk, voorzichtig niet om eventuele larven te vangen.
Breng larven over naar een nieuw petrischaaltje met 50 milliliter vers embryomedium. Herhaal het voer-, spoel- en overdrachtsproces gedurende twee extra dagen. Op de zesde dag na de bevruchting, beginnen met de voorbereiding van de fluorescerende voedsel door het toevoegen van 200 milligram gedroogd voedsel aan een 10 centimeter horloge glas.
Voeg 300 microliter fluorescerend etiket en 100 microliter gedeïsiseerd water toe en meng kort. Verdeel de resulterende pasta in een dunne laag op het horlogeglas en laat het minstens acht uur drogen bij kamertemperatuur, in het donker. Schraap hierna het gedroogde mengsel van het horlogeglas.
Plet tot een poeder en bewaar het op kamertemperatuur, in het donker. Voer op de zevende dag na de bevruchting het fluorescerende voedsel aan de larven door er twee milligram van te besprenkelen bovenop het water in elke petrischaal. Laat de larven twee uur voeden.
Bereid ondertussen de geconcentreerde doseeroplossingen voor door elke testverbinding in embryomedium op te lossen tot een concentratie die twee keer de doeldosis is met een eindvolume van ten minste 2,5 milliliter. Gebruik aan het einde van de voederperiode een transferpipet om ze naar een grote spoelschaal te verplaatsen. Spoel alle larven die eerder beschreven zijn met strenger stofzuigen.
Het is belangrijk om zoveel mogelijk van de overgebleven fluorescerende voedsel te verwijderen tijdens de laatste spoeling om de mogelijkheid dat het per ongeluk wordt overgebracht naar de 96-put plaat te verminderen. Nadat elke larve is gespoeld, gebruikt u een pipet om het samen met 100 microliters embryomedium uit de spoelschaal te halen. Doe de larve en de gehele 100 microliter van medium in een put van een 96-bron polystyreen, conische bodem, multi-well plaat.
Zodra alle larven zijn overgedragen, voeg 100 microliter van de voorbereide doseeroplossingen toe aan de juiste putten. Nadat alle doseeroplossingen zijn toegevoegd, laadt u de plaat in een plaatspectrofotometer. Meet de fluorescentie van de plaat vanaf de bodem, vijf keer achter elkaar, zonder de plaat te schudden.
De laagste meting van elke put zal worden aangewezen als de eerste fluorescentie tijdens de data-analyse. Broed de plaat uit op ongeveer 28 graden Celsius. Herhaal het meetproces, het lezen van de fluorescentie om de 20 minuten voor de eerste twee uur na het doseren, en uitbroeden tussen leest.
Meet de fluorescentie om de 30 minuten voor de derde en vierde uur na het doseren en maak vervolgens per uur metingen voor uren vijf tot acht. Broed de larven 's nachts uit op 28 graden Celsius. De volgende dag, lees de fluorescentie op 24 uur na het doseren.
Dit protocol maakt gebruik van op plaat gebaseerde spectrofotometrie om GI-transit te beoordelen als een vervanging met hoge doorvoer voor fluorescerende microscopie. Representatieve resultaten die deze twee methoden vergelijken, worden gegenereerd door identiek behandelde vis te analyseren gedurende een periode van 24 uur na het doseren. Zoals hier te zien, zijn de resultaten sterk gecorreleerd, met een negatieve helling omdat microscopie het behouden fluorescentiesignaal meet en spectrofotometrie het uitgezonden signaal meet.
Analyse van verbindingen met uiteenlopende mechanismen toont aan dat in vergelijking met voertuig behandelde controles, atropine en amitriptyline langzame GI doorvoer. Tegaserod en metoclopramide, aan de andere kant, worden gezien om de transittijd te versnellen. Erythromycine, die naar verwachting de transittijd zou versnellen op basis van de reactie van zoogdieren, heeft in plaats daarvan geen invloed op de transittijd van zebravissen.
Verdere analyse toont aan dat atropine gi-doorvoer vertraagt, afhankelijke dosis, in zebravissenlarven. De laagste geteste dosis, 042 micromolar, had geen significant effect. Terwijl de twee hogere doses worden elk gezien om aanzienlijke impact hebben.
Deze methode heeft vele toepassingen, met inbegrip van het opsporen van toxische GI effecten van drugs of kandidaat-geneesmiddelen, ziekte modellering, zoals prikkelbare darm syndroom, ontdekking van nieuwe therapieën voor dergelijke ziekten, evenals de ontdekking van pro-kinetische verbindingen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
