Please note that all translations are automatically generated.
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van neutrofiele extracellulaire vallen (netten) en het bedienen van NETQUANT, een volautomatische software optie voor het kwantificeren van netten in immunofluorescentie beelden.
Hier presenteren we NETQUANT, een volledig geautomatiseerde aanpak voor het kwantificeren van NETS en immunofluorescentie beelden. Dit zal onderzoekers helpen bij het maken van vergelijkbare beeldanalyse op gegevens gegenereerd door meerdere gebruikers en voorwaarden. De voordelen van deze techniek zijn het gebruiksgemak, eencellige data-analyse, meerdere criteria om NET-vorming te evalueren en een onbevooroordeelde analyse van meerdere afbeeldingen.
Installeer en open de analysesoftware. Een up-to-date versie is te vinden op het Zenodo GitHub archief, of de Nordonfelt Lab website. Kies op het tabblad Setup een bronmap voor analyse door op de optie Pad ophalen in het bronmenu te klikken.
Selecteer de map met de te analyseren afbeeldingsreeksen. Klik nogmaals op de optie Pad ophalen in het doelmenu en selecteer de doelmap voor het opslaan van de gegevens die de afbeeldingsanalyse volgen. Vervolgens, bij het gebruik van afzonderlijke kanaalbeelden, een naam van de kanaalmappen, zodat het DNA-kanaal overeenkomt met de nucleaire DNA-vlek, en het NET-kanaal toont de neutrofiele elastase vlek in de beelden.
Geef ook de map met de besturingselementafbeeldingsbestanden als controle. Klik vervolgens op de knop Afbeeldingsgegevens laden en laad de metagegevens van de afbeelding in de software. Selecteer vervolgens in het submenu kanaalvolgorde de juiste kanaalvolgorde in de afbeeldingen.
Dit helpt om toevallige mismatches te voorkomen. Klik nu op de knop Gegevens voorbereiden om primaire afbeeldingseigenschappen uit de ruwe gegevens te verkrijgen en de afbeeldingen om te zetten. De geconverteerde afbeeldingen worden vervolgens weergegeven in het submenu voorbeeldtypen.
Klik op het voorbeeldtypemenu, selecteer een afbeelding in het submenu en klik op weergavegegevens om de afbeeldingen weer te geven die zijn opgesplitst in respectievelijk het DNA- en Neutrophil Extracellular Trap of het NET-kanaal. Als u de cellen wilt segmenteren in hun respectieve kanalen, selecteert u het tabblad segmentatiemethode en selecteert u een methode in het submenu methode voor zowel de DNA- als de NET-kanalen. De standaardmethode voor segmentatie is ingesteld op adaptief en is de aanbevolen instelling.
Andere opties zijn beschikbaar in de software, waaronder global edge en chanverse. Een keerpunt optie is ook opgenomen om te helpen onderscheid maken tussen nauw geplaatste cellen of NETs. Klik ook op het tabblad segmentatie op de optie segmentbesturingselementen.
Selecteer vervolgens PMA in het submenu voorbeeldtype en klik op de batchoptie om te beginnen met het segmenteren van alle afbeeldingen die in de gegevensset zijn opgenomen. Selecteer vervolgens de afbeeldingen in het voorbeeldtypemenu en klik op de knop Weergavegegevens om de binaire afbeeldingsmaskers te visualiseren en te valideren voor zowel de DNA- als NET-maskers die na segmentatie zijn gegenereerd. Klik nu op het tabblad analyse op de knop Drempel bepalen om de besturingselementen te analyseren.
Wijzig vervolgens aan de rechterkant het monstertype in PMA en klik op de knop Celeigenschappen ophalen om de analyse van de gestimuleerde monsters te voltooien. Selecteer vervolgens een afbeelding in het submenu voorbeeldtype en klik op de knop Weergavegegevens om de overlay en het aantal cellen en NET-vormende cellen in de afbeelding weer te geven. Begin met het selecteren van het voorbeeld in het submenu voorbeeldtype.
Afzonderlijke afbeeldingen kunnen worden geselecteerd uit het submenu van het voorbeeldtype voor analyse of de volledige batch afbeeldingen kan worden geanalyseerd door de batchoptie te selecteren. Eenmaal geselecteerd, klikt u op de knop NETs analyseren om de analyse te voltooien. Pas netcriteria handmatig aan om optimale resultaten te behalen voor een bepaald monster.
Vergelijk geïdentificeerde NETs met de originele afbeeldingen om de kwaliteit van de identificatie te beoordelen. Zodra deze stap is voltooid, kunnen de NET-criteria worden toegepast op alle afbeeldingen in de gegevensset. Eventuele wijzigingen in de NET-criteria worden ook gelijktijdig toegepast op alle controlemonsters.
Controleer het gegevensoverzicht in het submenu celgegevens, waar het aantal afbeeldingen, het aantal cellen per afbeelding en het percentage NET's per afbeelding worden weergegeven. Voer het uitvoertabblad in om de resultatenuitgangen te selecteren en weer te geven. Verken en vergelijk de verschillende gegevensuitgangen die zijn gegenereerd uit de analyse van besturings- en PMA-behandelde monsters door de vorm van de uitvoer te selecteren en op de knop uitvoerresultaten te klikken.
Start vervolgens het CSV-bestand met de resultatengegevenstabel om gegevens met één cel te verkennen en klik op de pdf-bestanden voor de resultaten om de net-gebiedsverdeling en DE VERHOUDING DNA naar NET in de monsters te visualiseren. De rode lijn geeft de drempelwaarde in de grafieken aan. Tot slot, klik op de resultaten bivariate distributiebestand om het NET gebied versus vorm van DNA te bepalen.
Hier werden 15 beelden van controlenetrofielen en 15 beelden van PMA-gestimuleerde neutrofielen geanalyseerd in minder dan tien minuten. Het totale aantal cellen werd geteld en het percentage cellen met Neutrophil Extracellular Traps werd bepaald met behulp van de geautomatiseerde kwantificeringsmethode beschreven in dit artikel. Deze resultaten tonen aan dat PMA-gestimuleerde neutrofielen een groter gebied hebben, een toename van nucleaire vervorming en een hogere DNA-tot NET-ratio dan controlemonsters.
In combinatie met een 3D-grafiek vertonen de pma-gestimuleerde monsters vaak gebieden van aanscherpingsgroepen dan de controlemonsters. Tijdens het proberen van de procedure, is het belangrijk om te onthouden dat, hoewel de workflow werd getest met behulp van meerdere donoren, is het raadzaam dat de gebruiker moet beslissen over de software parameters op de juiste manier op basis van de individuele gegevensset.
