Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
הדמית מבוססת תמונה אוטומטית של מלכודות נויטרופילים באמצעות NETQUANT
Chapters
Summary November 27th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להפקת נויטרופילים מלכודות (רשתות) ו-NETQUANT הפעלה, תוכנה אוטומטית לחלוטין לכמת של רשתות בתמונות immunofluorescence.
Transcript
כאן אנו מציגים NETQUANT, גישה אוטומטית לחלוטין לכימות נטס ותמונות immunofluorescence. זה יעזור לחוקרים לבצע ניתוח תמונה דומה מנתונים שנוצרו על ידי משתמשים מרובים ותנאים. היתרונות של טכניקה זו הם קלות השימוש, ניתוח נתונים חד-תאי, קריטריונים מרובים להערכת היווצרות NET וניתוח לא משוחד של תמונות מרובות.
התקן ופתח את תוכנת הניתוח. גרסה עדכנית ניתן למצוא בארכיון Zenodo GitHub, או באתר האינטרנט של מעבדת נורדונפלט. בכרטיסיה הגדרה, בחר תיקיית מקור לניתוח על-ידי לחיצה על האפשרות קבל נתיב בתפריט המקור.
בחר את התיקיה המכילה את רצפי התמונות שיש לנתח. שוב, לחץ על האפשרות לקבל נתיב בתפריט היעד, ובחר את תיקיית היעד לשמירת הנתונים הבאים ניתוח תמונה. לאחר מכן, בעת שימוש בתמונות ערוץ נפרדות, תן שם לתיקיות הערוץ כך שערוץ הדנ"א יתאים לכתם הדנ"א הגרעיני, וערוץ NET מתאר את כתם האלסטאז של נויטרופילים בתמונות.
כמו כן, תן שם לתיקיה המכילה את קבצי תמונת הפקד כפקד. לאחר מכן, לחצו על לחצן 'טען פרטי תמונה' וטענו את המטה-נתונים של התמונה לתוכנה. לאחר מכן, בתפריט המשנה 'סדר ערוצים', בחרו בסדר הערוץ הנכון הכלול בתמונות.
פעולה זו מסייעת במניעת אי-התאמות מקריות. עכשיו לחץ על כפתור הכנת נתונים כדי להשיג מאפייני תמונה ראשוניים מהנתונים הגולמיים ולהמיר את התמונות. התמונות שהומרו יופיעו לאחר מכן בתפריט המשנה סוגים לדוגמה.
לחץ על תפריט סוג המדגם, בחר תמונה מתפריט המשנה ולחץ על נתוני תמונת התצוגה כדי להציג את התמונות לפצל לתוך ה-DNA ו נויטרופילים מלכודת Extracellular, או ערוץ NET, בהתאמה. כדי למקטע את התאים לערוצים המתאימים להם, בחר בכרטיסיה שיטת פילוח ובחר שיטה בתפריט המשנה של פעולת השירות הן עבור ה- DNA והן עבור ערוצי NET. שיטת ברירת המחדל של פילוח מוגדרת להתאמה והיא ההגדרה המומלצת.
אפשרויות אחרות זמינות בתוכנה כולל קצה גלובלי chanverse. אפשרות קו פרשת המים נכללה גם כדי לסייע להבחין בין תאים הממוקמים היטב או NETs. גם בכרטיסיה פילוח, לחץ על האפשרות דוגמאות פקד פלח שוק.
לאחר מכן בחרו PMA מתפריט המשנה לדוגמה ולחצו על אפשרות האצווה כדי להתחיל בפילוח של כל התמונות הכלולות בערכת הנתונים. לאחר מכן, בחרו בתמונות בתפריט סוג הדגימה ולחצו על לחצן נתוני תמונת התצוגה כדי להציג ולאמת את מסיכות התמונה הבינארית הן למסיכות הדנ"א והן למסיכות NET שנוצרו לאחר הפילוח. עכשיו, בכרטיסיה ניתוח, לחץ על כפתור הסף לקבוע לנתח את דוגמאות הפקד.
לאחר מכן, בצד ימין, לשנות את סוג המדגם PMA ולחץ על כפתור לקבל מאפייני תא כדי להשלים את הניתוח של דגימות מגורה. לאחר מכן, בחרו תמונה מתפריט המשנה של סוג הדגימה ולחצו על לחצן נתוני תמונת התצוגה כדי להציג את שכבת-המשנה ואת מספר התאים ותאי ה-NET המתגבשים בתמונה. התחל בבחירת הדוגמה מתפריט המשנה של הסוג לדוגמה.
ניתן לבחור תמונות בודדות מתפריט המשנה לדוגמה של סוג לניתוח או שניתן לנתח את כל אצוות התמונות על-ידי בחירה באפשרות האצווה. לאחר שנבחר, לחץ על כפתור לנתח NETs כדי להשלים את הניתוח. התאם את קריטריוני NET באופן ידני כדי להניב תוצאות מיטביות עבור מדגם נתון.
השווה NETs מזוהים עם התמונות המקוריות כדי להעריך את איכות הזיהוי. לאחר השלמת שלב זה, ניתן להחיל את קריטריוני NET על-פני כל התמונות בערכת הנתונים. כל השינויים שבוצעו בקריטריוני NET מוחלים בו-זמנית גם על כל דוגמאות הבקרה.
בדוק את סיכום הנתונים בתפריט המשנה של נתוני התא, שבו מוצגים מספר התמונות, ספירת התאים לתמונה ואחוז ה- NETs לתמונה. הזן את כרטיסיית הפלט כדי לבחור ולהציג את פלטי התוצאות. גלה והשווה את פלטי הנתונים השונים שנוצרו מניתוח דגימות בקרה ודגימות שטופלו ב- PMA על-ידי בחירת צורת הפלט ולחיצה על לחצן תוצאות הפלט.
לאחר מכן, הפעל את קובץ CSV של טבלת הנתונים של התוצאות כדי לחקור נתונים של תא יחיד ולחץ על קבצי PDF של תוצאות כדי להמחיש את התפלגות אזור NET ויחס DNA ל- NET בדגימות. הקו האדום מציין את ערך הסף בתרשים. לבסוף, לחץ על קובץ ההפצה bivariate תוצאות כדי לקבוע את אזור NET לעומת צורה של DNA.
כאן, 15 תמונות של נויטרופילים שליטה ו -15 תמונות של נויטרופילים מגורה PMA נותחו בפחות מעשר דקות. המספר הכולל של תאים נספרו ואחוז התאים עם מלכודות חוץ תאיות נויטרופילים נקבע באמצעות שיטת הכימות האוטומטית המתוארת במאמר זה. תוצאות אלה מראות כי נויטרופילים מגורה PMA יש שטח גדול יותר, עלייה דפורמציה גרעינית, ויחס DNA ל- NET גבוה יותר מאשר דגימות בקרה.
בשילוב לגרף תלת-ממדי, הדגימות הממריצות PMA נוטות להראות אזורים של הידוק קיבועים מאשר דגימות הבקרה. בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור שלמרות שזרימת העבודה נבדקה באמצעות תורמים מרובים, מומלץ שהמשתמש יחליט על פרמטרי התוכנה בהתאם על סמך ערכת הנתונים הבודדת.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
