Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Plant vækst og Agrobacterium-medieret Floral-dip Transformation af Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Agrobacterium-medieret transformation ved hjælp af en blomster-dip metode kan anvendes med succes at skabe stabile transgene linjer af extremophyte model Schrenkiella parvula. Vi præsenterer en protokol, der er ændret fra at for Arabidopsis thaliana, overvejer forskellige vækst vaner og fysiologiske egenskaber af extremophyte.
Transcript
Denne metode, en reproducerbar transformationsprotokol for Schrenkiella parvula, kan hjælpe med at besvare spørgsmål inden for planteparativ og funktionel genoming, især undersøgelser, der undersøger plantetilpasninger til barske miljøer. Denne teknik muliggør undersøgelser af rutinemæssige funktioner i Schrenkiella parvula på extremophyte tilpasset multi-ion salt belastninger. Det giver også mulighed for sammenlignende undersøgelser, som også ser på sin nære slægtning, moderen forælder Aribidopsis Thaliana.
Sammenligning af Schrenkiella Parvula med Aribidopsis Thaliana kan give indsigt i afvigelser i genregulering og -funktion, der muliggør unik tilpasning af Schrenkiella parvula. Transformationsprotokollen for Arabidopsis Thaliana er allerede veletableret. Metoden muliggør nu sammenlignende undersøgelser med transgene Schrenkiella Parvula-planter.
Generelt forskere nye til denne metode vil kæmpe på grund af blomstring vane og bladet morfologi Schrenkiella Parvula planter, der gør effektiv transformation ved hjælp af en flora dip samt udvælgelsen af sande transformanter vanskeligt. Til at begynde, bruge en våd tandstikker til at overføre omkring 20 til 25 S.Parvula frø på våd jord. Derefter stratificere frøene ved fire grader celsius i fem til syv dage.
Efter stratificering, returnere frøene til vækstkammeret i syv til 10 dage. Når alle planter har spiret, lad kun én kimplante i hver af de fire hjørner og i midten af potterne. Dyrk planterne i otte til 10 uger i vækstkammeret, indtil de blomstrer.
På transformationsdagen skal du vælge S.Parvula-planter i henhold til tekstprotokollen. Brug snørebånd og små saks til at fjerne eventuelle besvingede blomsterstande, der allerede udvikler sig til siliques. Når planterne er klar, forberede en agrobacterium infiltration løsning.
Derefter dyppes S.Parvula-blomsterstanden i agrobacteriuminfiltrationsopløsning i 20 sekunder. Vist her er den tidligste fase af de planter, der kan bruges til transformation, så længe allerede udviklede siliques fjernes før transformation, ældre planter med flere blomster kan bruges. Efter omdannelsen, sted blomst dyppet planter vandret i rene bakker med kupler til at dække planterne.
Derefter placere planterne i en mørk vækst rum i en til to dage. Returner planterne til en oprejst position og overføre dem til vækstrummet. I den følgende uge, overvåge dyppet blomsterstande.
Ti dage efter den første blomsterdukker vil S.Parvula planter fortsætte med at producere nye blomsterstande og siliques. En anden runde af blomster dip kan udføres for yderligere at omdanne de nye blomsterstande. Dyrk planterne, indtil frøene modnes, og høst frøene omkring 21 uger.
Tør frøene i to til tre uger ved stuetemperatur i en lufttæt beholder fyldt med tørremidler. Plant T en frø i henhold til teksten protokol. Dyrk planterne, indtil de første to til tre sande blade udvikle.
For at udføre det første valg for herbicid modstand, fortyndes glufosinat ammonium herbicid og spray det på planterne. Dæk planterne med kuplerne natten over. Sæt bakkerne tilbage til vækstrummet, og fjern kuplen.
Vent, indtil de fleste af de planter er udvalgt ud af herbicid. For at begynde det andet valg skal du identificere de planter, der overlever efter at være blevet sprøjtet tre til fire gange med BASTA-løsningen. Efter dyrkning af planterne i to til tre uger mere, skal du vælge den største modne blad på hver plante.
Næste gnid overfladen af bladet forsigtigt med en finger for at fjerne voks lag. Anskaf derefter en dråbe af den fortyndede BASTA-opløsning på bladet. Hold øje med de blade, der er behandlet med BASTA-opløsningen, for tegn på visne i op til en uge.
Endelig vælge planter med blade upåvirket af BASTA dråber til yderligere analyse. I denne protokol blev S.Parvula omdannet med agrobacterium ved hjælp af en blomsterdip metode. Infektion med agrobacterium resulterede i abort af nogle blomster.
Men S.Parvula planterne fortsatte med at producere nye blomster efter den første blomst dypning, og kunne omdannes igen. Ved hjælp af BASTA spray og drop test, kan ægte positive transformanter præcist identificeres. Antallet af prøver, der er testet ved hjælp af PCR-bekræftelse, kan reduceres.
Mens denne metode svarer til omdannelsen af Arabidopsis Thaliana, er det vigtigt at huske forskellene i vækst og morfologi af Schrenkiella Parvula. Ændring af protokollen, så den afspejler disse forskelle, er afgørende for en vellykket transformation. Denne teknik kan hjælpe forskere med at udforske udviklingen af genomiske variationer, der fører til flere salt stress tilpasninger i extremophyte model, Schrenkiella Parvula.
Ved at kombinere denne teknik med oplysninger om Aradopsis Thalianas funktioner, en anden plante nært beslægtet med Schrenkiella Parvula. Forskere kan studere variationer i forordningen og funktioner, at disse er to forskellige strukturer mellem disse to arter. Under transformationsprocessen er det vigtigt at indeholde alle agrobacterium infiltrationsopløsningen i autoklavelige beholdere.
Sterilisere og sikkert kassere alle de materialer, der kom i kontakt med agrobacterium herunder handsker, makro pipette tips, og papirhåndklæder.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE