Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Vekst og Agrobacterium-mediert Floral-dip transformasjonen av Extremophyte Schrenkiella parvula
Summary January 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Agrobacterium-mediert transformasjon bruke en floral-dip kan brukes å opprette stabil transgene linjer av extremophyte modellen Schrenkiella parvula. Vi presenterer en protokoll endret fra det for Arabidopsis thaliana, vurderer ulike vekst vaner og fysiologiske kjennetegner extremophyte.
Transcript
Denne metoden, en reproduserbar transformasjonsprotokoll for Schrenkiella parvula, kan bidra til å svare på spørsmål innen komparativ og funksjonell genoming, spesielt studier som undersøker plantetilpasninger til tøffe miljøer. Denne teknikken muliggjør undersøkelser av rutinemessige funksjoner i Schrenkiella parvula på ekstremophyte tilpasset multi-ion salt stress. Det muliggjør også komparative studier som også ser på sin nære slektning, mor foreldre Aribidopsis Thaliana.
Sammenligning av Schrenkiella Parvula med Aribidopsis Thaliana kan gi innsikt i avvik i genregulering og funksjon som muliggjør unik tilpasning av Schrenkiella parvula. Transformasjonsprotokollen for Arabidopsis Thaliana er allerede godt etablert. Metoden muliggjør nå komparative studier ved hjelp av transgene Schrenkiella Parvula planter.
Generelt forskere nye til denne metoden vil slite på grunn av blomstrende vane og blad morfologi av Schrenkiella Parvula planter som gjør effektiv transformasjon ved hjelp av en flora dip samt valg av sanne transformants vanskelig. Til å begynne med, bruk en våt tannpirker til å overføre ca 20 til 25 S.Parvula frø på våt jord. Deretter stratifisere frøene på fire grader celsius i fem til syv dager.
Etter stratifisering, returnere frøene til vekstkammeret i syv til 10 dager. Når alle plantene har spiret, la bare en frøplante i hvert av de fire hjørnene og i midten av pottene. Vokse plantene i åtte til 10 uker i vekstkammeret til de blomstrer.
På transformasjonsdagen velger du S.Parvula-anlegg i henhold til tekstprotokollen. Bruk tang og liten saks for å fjerne eventuelle pollinerte blomsterstander som allerede utvikler seg til siliques. Etter at plantene er klare, lag en agrobacterium infiltrasjonsløsning.
Etter dette dypper du S.Parvula-blomsterstanden i agrobacterium infiltrasjonsløsning i 20 sekunder. Vist her er den tidligste fasen av plantene som kan brukes til transformasjon, så lenge allerede utviklede siliques fjernes før transformasjon, kan eldre planter med flere blomster brukes. Etter transformasjonen, plasser blomsterdyppet planter horisontalt i rene skuffer med kupler for å dekke plantene.
Plasser deretter plantene i et mørkt vekstrom i en til to dager. Returner plantene til en oppreist stilling og overfør dem til vekstrommet. I den påfølgende uken, overvåke de dyppet blomsterstander.
Ti dager etter den første blomsterdyppen vil S.Parvula-plantene fortsette å produsere nye blomsterstander og siliques. En ny runde med blomsterdukk kan utføres for å ytterligere forvandle de nyvoksende blomstene. Dyrking plantene til frøene modnes, og høst frøene rundt 21 uker.
Tørk frøene i to til tre uker ved romtemperatur i en lufttett beholder fylt med tørkemidler. Plant T en frø i henhold til tekstprotokollen. Dyrke plantene til de første to til tre sanne bladene utvikler seg.
For å utføre det første valget for ugressmiddelresistens, fortynne glufosinate ammonium ugressmiddel og spray det på plantene. Dekk plantene med kuplene over natten. Sett skuffene tilbake til vekstrommet, og fjern kuppelen.
Vent til de fleste plantene er valgt ut av ugressmiddelet. For å begynne det andre valget, identifiser plantene som overlever etter å ha blitt sprayet tre til fire ganger med BASTA-løsningen. Etter å ha dyrket plantene i to til tre uker, velg det største modne bladet på hver plante.
Deretter gni overflaten av bladet forsiktig med en finger for å fjerne vokslaget. Legg deretter en dråpe av den fortynnede BASTA-løsningen på bladet. Overvåk bladene behandlet med BASTA-løsningen for tegn på visner i opptil en uke.
Til slutt velger du plantene med blader upåvirket av BASTA-dråpene for videre analyse. I denne protokollen ble S.Parvula forvandlet med agrobacterium ved hjelp av en floral dip metode. Infeksjon med agrobacterium resulterte i abort av noen blomster.
Men S.Parvula-plantene fortsatte å produsere nye blomster etter den første blomstdyppingen, og kunne forvandles igjen. Ved hjelp av BASTA spray og slipp tester, kan ekte positive transformanter identifiseres nøyaktig. Antall prøver som er testet ved hjelp av PCR-bekreftelse, kan reduseres.
Mens denne metoden ligner transformasjonen av Arabidopsis Thaliana, er det viktig å huske forskjellene i vekst og morfologi av Schrenkiella Parvula. Endring av protokollen for å gjenspeile disse forskjellene er avgjørende for vellykket transformasjon. Denne teknikken kan hjelpe forskere med å utforske utviklingen av genomiske variasjoner som fører til flere saltstresstilpasninger i ekstremophyte-modellen, Schrenkiella Parvula.
Kombinere denne teknikken med informasjon om funksjonene til Aradopsis Thaliana, en annen plante nært knyttet til Schrenkiella Parvula. Forskere kan studere variasjonene i reguleringen og funksjoner som dette er to forskjellige strukturer mellom disse to artene. Under transformasjonsprosessen er det viktig å inneholde all agrobacterium infiltrasjonsløsning i autoklaverbare beholdere.
Steriliser og kast alle materialene som kom i kontakt med agrobacterium, inkludert hansker, makropipettespisser og papirhåndklær.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
