Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisering og sporing endogene mRNAs i levende Drosophila melanogaster ægge kamre
Chapters
Summary June 4th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en protokol for visualisering, afsløring, analyse og sporing af endogene mRNA handel i levende Drosophila melanogaster æg kammer ved hjælp af molekylære beacons, spinning Disc confokal mikroskopi, og open source-analyse Software.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i RNA biologi området om mekanismen og funktionen af polariseret RNA lokalisering. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for realtid visualisering af endogene RNA handel med levende væv. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod behandling af RNA-relaterede sygdomme, fordi det har potentiale til at afdække nye terapeutiske mål.
Selvom denne metode kan give indsigt i RNA-processer i frugtflueægkammeret, kan den også anvendes på andre systemer som i zebrafisk eller kulturceller. Generelt vil personer nye til denne metode kæmpe på grund af de udfordringer, der er forbundet med design og levering af de molekylære beacon rekvisitter. For molekylær beacon mikroinjektion, skal du vælge 40X olie mål og montere en coverslip med de dissekerede æg kammer på mikroskopet fase.
Find et æg kammer i midten til slutningen af udviklingsmæssige fase, der er korrekt orienteret for mikroinjektion. Derefter oprettes en mikroinjektor med det relevante injektions- og kompensationstryk. Brug mikromanipulatorens joystick, sænk forsigtigt en nål fyldt med en mikroliter molekylær beacon-opløsning i oliedråben.
Bring spidsen i fokus mod periferien af synsfeltet. Udfør en ren funktion for at fjerne luften fra nålespidsen og for at sikre, at der er flow fra nålen, og før nålen til hjemmet. Fokus på æggekammeret, der skal mikroindsprøjtes og bringe nålen tilbage i fokus nær kanten af æggekammeret.
Udfør en fin justering af z-positionen af målet, således at membranen adskiller follikelcellerne fra sygeplejerskecellerne er i fokus. Sæt nålen i en sygeplejerskecelle til injektion af de molekylære beacons over en periode på to til fem sekunder. For at sikre reproducerbar mikroinfektion succes, fokusere omhyggeligt på membranen adskiller follikelceller og sygeplejerske celler, der vil blive injiceret, samtidig med at spidsen af nålen i fokus med mikro manipulator.
Når alle de molekylære beacons er blevet injiceret, forsigtigt fjerne nålen og trække den tilbage til hjemmet position. Skift målsætningen til den ønskede forstørrelse for billederhvervelse. Derefter fokusere på æggekammeret under det nye mål og begynde billedet erhvervelse.
For spot detektion af de molekylære beacons, åbne billederne i Billede J.Brug konvertere til ICY værktøj til at konvertere billederne tilbage til IV. En skala bar vil automatisk blive overlejret på stakken. Rediger skalalinjen via kontrollørens vindue efter behov.
Aktivér derefter øjeikonet for skalalinjen under lagfanen for at fjerne skalalinjen fra den oprindelige stak. Vælg registrering og sporing, registrering og staffagedetektor, og bekræft, at den aktuelle sekvensinputdetektering og kanalnul vælges for henholdsvis input- og forbehandlingsparametrene. For detektor, skal du vælge opdage lyspunkt over mørk baggrund ved hjælp af magt brug af 2D bølgelængder til 3D, hvis der ikke er nok z-skiver i stakkene til at udføre analysen.
Vælg skaler og følsomhed for hver skala, der tilføjer flere skalaer for større pletter, og bekræft, at området af interesse fra sekvens er indstillet til interesseområder. I tilfælde af filtrering skal du bekræfte, at der ikke er angivet nogen filtrering, og vælge det relevante filformat under output. Hvis spotdetektorresultaterne skal bruges til sporingsanalyse, skal du vælge eksport til svømmehal.
Gentag spotregistreringen for den anden kanal for at analysere farvekalkningsanalyse. For at spore de molekylære beacon pletter, skal du vælge detektion og sporing, sporing, spot tracking, og køre spotdetektoren ved hjælp af de samme parametre som for stedet afsløring. Klik på estimatparametre, og vælg den ønskede målbevægelse i pop op-vinduet til estimering af parametre.
Klik derefter på kør sporing. Hvis du vil visualisere sporene, skal du vælge registrering og sporing, sporing og sporstyring. I tilfælde af farvesporsprocessor skal du vælge aktivér og vælge en farve til sporene.
Vælg sporprocessortidsklip fra tilføj sporprocessor. I vinduet checkklipper skal du angive det antal registreringer, der skal vises før og efter det aktuelle tidspunkt. Gem sporoplysningerne som en XML-sporfil, og brug kameraikonet til at få et skærmbillede af resultaterne.
Hvis du vil projicere stakken langs z-retningen, skal du bruge søgelinjen til at finde plug-in'et og vælge maksimal projektion i rullemenuen. Vælg sekvensfane, lærred og rotation i inspektørvinduet for at justere billedet til den ønskede retning og få et skærmbillede af det roterede billede. Vælg derefter interesseområde, 2D-område af interesse, vælg område af interesseform, og vælg det område, der er af interesse på billedet til beskæring.
Installer tidsstempel overlay plugin og tilføje et tidsstempel følge instruktionerne i popup-vinduet for retninger om, hvordan du placerer og formatere tidsstemplet. Hvis du vil ændre eller tilføje tidsintervallet, skal du klikke på Rediger i vinduet med sekvensegenskaber. Aktivér øjeikonet for at tilføje skaleret tilbage under lagfanen i inspektørvinduet.
Derefter få et skærmbillede af de tidsstemplede resultater og gemme billedet i både TIFF og AVI formater. Ved hjælp af denne metode som påvist er det muligt at visualisere transport- og lokaliseringsmønstrene for endogene mRNA'er via molekylære beacons på forskellige stadier af oogenese og især ved og efter midten af oogenese. Når individuelt injiceres i samme fase æg kamre, forskellige oskar specifikke molekylære beacons præsentere det samme mønster af lokalisering.
Molekylære beacons sprøjtes ind i cytoplasmaet af en sygeplejerske celle vil frit diffuse i tilstødende sygeplejerske celler samt i oocyt. Således beacons er i stand til at hybridisere med deres mål og generere fluorescens signaler på andre steder end microinjection site. I oskar GFP transgene æg kamre i midten af oogenese, analyse af erhvervelse data viser omfattende colocalization for fluorescens signal af genetisk manipuleret GFP mærkede oskar mRNA med fluorescens signal opdaget ved hjælp af molekylære beacons.
Desuden kan 5D stakke analyseres yderligere for at bestemme oskar mRNA baner til langdistancetransport i både sygeplejerske celle og oocyt cytoplasma. Efter sin udvikling banede denne teknik vejen for forskere inden for RNA-biologi til at udforske endogene mødre mRNA transport og lokalisering i Drosophila ægkammer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
