Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
दृश्य और ट्रैकिंग अंतर्जात MRNAs में लाइव Drosophila मेलेनोगैस्टर अंडे मंडलों
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
यहाँ, हम आणविक बीकन का उपयोग कर रहते Drosophila melanogaster अंडे कक्ष में अंतर्जात MRNA तस्करी के दृश्य, पता लगाने, विश्लेषण और ट्रैकिंग के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, कताई डिस्क confocal माइक्रोस्कोपी, और खुला स्रोत विश्लेषण सॉफ्टवेयर.
Transcript
यह विधि ध्रुवीकृत आरएनए स्थानीयकरण के तंत्र और कार्य के बारे में आरएनए जीव विज्ञान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह जीवित ऊतकों में अंतर्जात आरएनए तस्करी के वास्तविक समय के दृश्य के लिए अनुमति देता है। इस तकनीक के निहितार्थ आरएनए से संबंधित रोगों की चिकित्सा की ओर विस्तार क्योंकि यह एक नए चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर करने की क्षमता है ।
हालांकि यह विधि फल फ्लाई अंडे के कक्ष में आरएनए प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन इसे जेब्राफिश या संस्कृति कोशिकाओं जैसे अन्य प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है। आम तौर पर, इस विधि के लिए नए व्यक्ति आणविक बीकन रंगमंच की सामग्री के डिजाइन और वितरण से जुड़ी चुनौतियों के कारण संघर्ष करेंगे। आणविक बीकन माइक्रोइंजेक्शन के लिए, 40X तेल उद्देश्य का चयन करें और माइक्रोस्कोप चरण पर विच्छेदित अंडे के कक्ष के साथ एक कवरस्लिप माउंट करें।
मध्य से देर से विकास के चरण में एक अंडा कक्ष का पता लगाएं जो माइक्रोइंजेक्शन के लिए ठीक से उन्मुख है। फिर उचित इंजेक्शन और मुआवजे के दबाव के साथ एक माइक्रोइंजेक्टर स्थापित करें। माइक्रो मैनिपुलेटर जॉयस्टिक का उपयोग करके, तेल की बूंद में आणविक बीकन समाधान के एक माइक्रोलीटर से भरी सुई को धीरे-धीरे कम करें।
देखने के क्षेत्र की परिधि की ओर ध्यान में टिप लाओ । सुई टिप से हवा को हटाने और यह सुनिश्चित करने के लिए कि सुई से प्रवाह है और सुई को घर की स्थिति में लाने के लिए एक साफ कार्य करें। अंडे के कक्ष पर ध्यान केंद्रित करने के लिए microinjected हो सकता है और सुई वापस अंडे चैंबर के किनारे के पास ध्यान में लाने के लिए ।
उद्देश्य के जेड-स्थिति का एक अच्छा समायोजन करें जैसे कि नर्स कोशिकाओं से कूप कोशिकाओं को अलग करने वाली झिल्ली ध्यान में है। दो से पांच सेकंड की अवधि में आणविक बीकन के इंजेक्शन के लिए एक नर्स सेल में सुई डालें। प्रजनन योग्य माइक्रोइंजेक्शन सफलता सुनिश्चित करने के लिए, कूप कोशिकाओं और नर्स कोशिकाओं को अलग करने वाली झिल्ली पर ध्यान केंद्रित करें जिन्हें माइक्रो मैनिपुलेटर के साथ ध्यान में रखते हुए सुई की नोक लाने के दौरान इंजेक्ट किया जाएगा।
जब सभी आणविक बीकन इंजेक्शन लगाए गए हों, तो धीरे-धीरे सुई को हटा दें और इसे घर की स्थिति में वापस ले लें। छवि अधिग्रहण के लिए वांछित आवर्धन के लिए उद्देश्य बदलें। फिर नए उद्देश्य के तहत अंडे के चैंबर पर ध्यान केंद्रित करें और छवि अधिग्रहण शुरू करें।
आणविक बीकन का स्पॉट डिटेक्शन के लिए, इमेज जे में छवियों को खोलें छवियों को बर्फीले उपकरण में परिवर्तित करने का उपयोग करें ताकि छवियों को वापस बर्फीले में परिवर्तित किया जा सके। एक पैमाने पर बार स्वचालित रूप से ढेर पर मढ़ा जाएगा । आवश्यक के रूप में निरीक्षक खिड़की के माध्यम से स्केल बार संपादित करें।
फिर मूल स्टैक से स्केल बार को हटाने के लिए लेयर टैब के नीचे स्केल बार के लिए आई आइकन को निष्क्रिय करें। डिटेक्शन और ट्रैकिंग, डिटेक्शन और स्पॉट डिटेक्टर का चयन करें, और वर्तमान अनुक्रम इनपुट डिटेक्शन की पुष्टि करें और चैनल शून्य को इनपुट और प्रीप्रोसेसिंग मापदंडों के लिए क्रमशः चुना जाता है। डिटेक्टर के लिए, विश्लेषण करने के लिए ढेर में पर्याप्त जेड-स्लाइस न होने पर ही 3डी तरंगदैर्ध्य के बल उपयोग का उपयोग करके अंधेरे पृष्ठभूमि पर उज्ज्वल स्थान का पता लगाएं।
बड़े स्थानों के लिए अधिक पैमाने को जोड़ने के लिए तराजू और संवेदनशीलता का चयन करें और इस बात की पुष्टि करें कि अनुक्रम से ब्याज का क्षेत्र ब्याज के क्षेत्र के लिए निर्धारित है। फ़िल्टर करने के लिए, पुष्टि करें कि कोई फ़िल्टरिंग सेट नहीं की गई है और आउटपुट के तहत उपयुक्त फ़ाइल प्रारूप का चयन करें। यदि स्पॉट डिटेक्टर परिणामों को ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना है, स्विमिंग पूल के लिए निर्यात का चयन करें ।
कोलोकैलाइजेशन एनालिसिस के लिए दूसरे चैनल के लिए स्पॉट डिटेक्शन दोहराएं। आणविक बीकन स्पॉट को ट्रैक करने के लिए, स्पॉट डिटेक्शन के लिए समान मापदंडों का उपयोग करके डिटेक्शन और ट्रैकिंग, ट्रैकिंग, स्पॉट ट्रैकिंग का चयन करें और स्पॉट डिटेक्टर चलाएं। अनुमान मापदंडों पर क्लिक करें और पैरामीटर अनुमान पॉपअप विंडो में वांछित लक्ष्य गति का चयन करें।
इसके बाद रन ट्रैकिंग पर क्लिक करें। पटरियों की कल्पना करने के लिए, पता लगाने और ट्रैकिंग, ट्रैकिंग, और ट्रैक प्रबंधक का चयन करें। रंग ट्रैक प्रोसेसर के लिए, पटरियों के लिए एक रंग का चयन करें और चुनें।
ऐड ट्रैक प्रोसेसर से, ट्रैक प्रोसेसर टाइम क्लिप चुनें। चेक क्लिपर विंडो में, वर्तमान समय बिंदु से पहले और बाद में दिखाए जाने वाले डिटेक्शन की संख्या दर्ज करें। एक्सएमएल ट्रैक फ़ाइल के रूप में ट्रैक जानकारी सहेजें और परिणामों का स्क्रीनशॉट प्राप्त करने के लिए कैमरा आइकन का उपयोग करें।
जेड-दिशा के साथ स्टैक को प्रोजेक्ट करने के लिए, प्लगइन खोजने के लिए खोज बार का उपयोग करें और ड्रॉपडाउन मेनू से अधिकतम प्रक्षेपण का चयन करें। इंस्पेक्टर विंडो में, इमेज को मनचाए ओरिएंटेशन में एडजस्ट करने और घुमाए गए इमेज का स्क्रीनशॉट हासिल करने के लिए सीक्वेंस टैब, कैनवास और रोटेशन का चयन करें। फिर ब्याज के क्षेत्र का चयन करें, ब्याज के 2D क्षेत्र, ब्याज आकार के क्षेत्र का चयन करें, और फसल के लिए छवि पर ब्याज के क्षेत्र का चयन करें ।
टाइमस्टैंप ओवरले प्लगइन स्थापित करें और टाइमस्टैंप को कैसे रखें और प्रारूप में निर्देशों के लिए पॉपअप विंडो में निर्देशों का पालन करते हुए एक टाइमस्टैंप जोड़ें। समय अंतराल को बदलने या जोड़ने के लिए, अनुक्रम गुण विंडो में संपादित करें। निरीक्षक खिड़की में लेयर टैब के नीचे स्केल बार को वापस जोड़ने के लिए आई आइकन को सक्रिय करें।
फिर टाइमस्टैंप किए गए परिणामों का स्क्रीनशॉट प्राप्त करें और झगड़ा और एवीआई दोनों प्रारूपों में छवि को सहेजें। इस विधि का उपयोग करते हुए, ओजेनेसिस के विभिन्न चरणों में और विशेष रूप से मध्य ऊजेनेसिस के बाद आणविक बीकन के माध्यम से अंतर्जात ंrnAs के परिवहन और स्थानीयकरण पैटर्न की कल्पना करना संभव है। जब व्यक्तिगत रूप से एक ही चरण अंडे कक्षों में इंजेक्शन, अलग ओस्कर विशिष्ट आणविक बीकन स्थानीयकरण का एक ही पैटर्न मौजूद है ।
एक नर्स सेल के साइटोप्लाज्म में इंजेक्ट किए गए आणविक बीकन स्वतंत्र रूप से आसन्न नर्स कोशिकाओं के साथ-साथ ओसाइट में फैलजाएंगे। इस प्रकार, बीकन अपने लक्ष्यों के साथ संकरण करने और माइक्रोइंजेक्शन साइट की तुलना में अन्य साइटों पर फ्लोरेसेंस सिग्नल उत्पन्न करने में सक्षम हैं। मिड ऊजेनेसिस में ओस्कर जीएफपी ट्रांसजेनिक अंडे कक्षों में, अधिग्रहण डेटा के विश्लेषण से आनुवंशिक रूप से इंजीनियर जीएफपी टैग किए गए ओस्कर एमआरएनए के फ्लोरेसेंस सिग्नल के फ्लोरेसेंस सिग्नल के लिए व्यापक कोलोकैलाइजेशन से पता चलता है।
इसके अलावा, नर्स सेल और ओसाइट साइटोप्लाज्म दोनों में लंबी दूरी के परिवहन के लिए ओस्कर एमआरएनए प्रक्षेप पथ निर्धारित करने के लिए 5डी स्टैक का और विश्लेषण किया जा सकता है। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने आरएनए जीव विज्ञान के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए ड्रोसोफिला अंडा कक्ष में अंतर्जात मातृ एमआरएनए परिवहन और स्थानीयकरण का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।
Tags
जीव विज्ञान अंक 148 आणविक बीकन लाइव सेल इमेजिंग अंतर्जात MRNA दृश्य MRNA तस्करी Drosophila मेलेनोगैस्टर अंडा कक्ष अंडा कक्ष microinsinctions colocalization कण ट्रैकिंग.Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
