Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Directe intrathecale injectie van recombinante Adeno-geassocieerde virussen in volwassen muizen
Chapters
Summary February 15th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier presenteren we een directe intrathecale injectietechniek gebruik van 1% lidocaïne waterstofchloride in een virale oplossing om te zorgen voor efficiënte adeno-associated virus levering aan kleine dieren en een scoresysteem te voorspellen transductie efficiëntie in het midden zenuwstelsel volgens de graad van tijdelijke zwakte veroorzaakt door lidocaïne.
Transcript
Deze methode vergemakkelijkt de efficiënte intrathecale levering van adeno-geassocieerde virale transgenes in wakkere kleine dieren voor de experimentele behandeling van ziekten van het centrale zenuwstelsel zoals ALS. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de virale oplossing 1% lidocaïnehydrochloride bevat dat een voorbijgaande verlamming veroorzaakt na een succesvolle injectie. Hoewel deze methode een visuele indicator biedt voor het beoordelen van het succes van de intrathecale geautomatiseerde situatie, is voldoende praktijk essentieel om het slagingspercentage van de levering te verbeteren.
Voordat u met de procedure begint, bevestigt u een naald van 27 meter aan een 25 microliter Hamilton-spuit en lijnt u de schuine punt van de naald uit met de volumetrische schaal op de spuit. Laad vervolgens voorzichtig 8 microliter van 4 x 10 tot de 10e genoomkopieën van de virusoplossing in de spuit, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Plaats vervolgens een wakkere 30 tot 70 dagen oude 12 tot 30 gram muis op een bed stuk in de gevoelige positie in een bioveiligheid kap en bedek het bovenlichaam met steriel gaas om de muis te kalmeren en om te voorkomen dat gebeten.
Stevig grip op de muis op zijn bekkengordel met de duim aan de ene kant en de wijsvinger en middelvinger aan de andere kant houden van de huid tussen de bilaterale bekkengordels strak met een duim en wijsvinger. Scheer vervolgens de vacht tussen de bilaterale bekkengordels en steriliseer de blootgestelde huid met een jodiumgebaseerde scrub en 70% ethanol. Voor directe intrathecale levering van de adeno-geassocieerde virusoplossing, palpate de intervertebrale ruimte langs de middellijn tussen de bilaterale bekkengordels en gebruik een vingernagel om een inkeping in de huid te drukken om de L5 aan L6 tussenwervelruimte aan te geven.
Draai de basis van de staart lichtjes en voorzichtig om de middellijn van de wervelkolom te onthullen en pas de schuine kant van de naald aan de kop van het dier aan. Met de muis stevig in positie, lijn de naald langs de middellijn van de wervelkolom en steek de naald voorzichtig en verticaal in het midden van de inkeping houden van de spuit in een centraal sagittale vlak. Wanneer de naald in contact komt met het bot, langzaam verminderen van de hoek tot ongeveer 30 graden en schuif de naald in de tussenwervel ruimte.
Een plotselinge staart flick is een teken van een succesvolle binnenkomst in de intradurale ruimte. Wanneer de naald de tussenwervelruimte binnenkomt, voelt de punt stevig vastgeklemd. Injecteer de vectoroplossing en houd de naald gedurende één minuut in de intradurale ruimte.
Trek vervolgens langzaam de naald met rotatie om lekkage te minimaliseren. Scoor onmiddellijk de voorbijgaande zwakte van de muisledematen om de injectiekwaliteit te evalueren en de muis terug te brengen naar zijn kooi voor herstel van de verlamming. Bevestig op het juiste experimentele eindpunt de ledematen en het hoofd van de geïnjecteerde muis in de gevoelige positie op een schuimdoosdeksel en gebruik een schaar om de huid van het hoofd naar het heiligbeen te strippen en te verwijderen.
Klem de schedel tussen de ogen, snijd langs de middellijn van de schedel en de horizontale lijn boven het cerebellum en open de schedel aan elke kant. Gebruik een pincet om het occipitaal bot te verwijderen en gebruik oogheelkundige schaar om het ruggenmergkanaal bilateraal te openen. Snijd de ribben aan beide zijden en verwijder voorzichtig het bovenste deel van de wervels.
Gebruik gebogen pincet om de hersenen op te heffen en de zenuwen van de schedelbasis te verbreken. Dan zorgvuldig extraheren van de hele hersenen en het ruggenmerg en bevestig de weefsels in 4%paraformaldehyde voor 24 uur. Aan het einde van de fixatieperiode beschermt cryoprotect de hersenen en het rug- en lumbale ruggenmerg in 30% sacharoseoplossing 's nachts bij 4 graden Celsius, gevolgd door inbedden in een optimale snijtemperatuursamenstellingsamenstelling voordat de vrieskou in vloeibare stikstof wordt ingevroren.
Gebruik vervolgens een cryostat om 25 micrometer dikke delen van elk weefsel te verkrijgen, waarbij de bevroren secties in 0,01 molaire PBS worden opgeslagen bij 4 graden Celsius zoals ze worden verkregen. Voor immunohistochemische analyse van de weefsels, pretreat de vrij zwevende secties met 1% waterstofperoxide gedurende 10 minuten, gevolgd door een 10 minuten wassen in PBS. Vervolgens broeden de monsters in het blokkeren van oplossing met 5% serum en 0,3% niet-ionisch wasmiddel in PBS gedurende 1 uur, gevolgd door 's nachts etikettering op 4 graden Celsius met de juiste primaire antilichamen van belang.
De volgende dag was je de secties met 3 10 minuten wasbeurten in PBS plus Tween en broed de glijbanen uit met de juiste bijbehorende biotinylated secundaire antilichamen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur na de laatste wasbeurt. Aan het einde van de incubatie, was de secties 3 keer in verse PBST zoals net aangetoond en incubeer de monsters met oneindig biotine peroxidase complex gedurende 40 minuten, gevolgd door vlekken met een geschikte chromogene agent. Monteer de gelabelde secties op glazen microscoopplaten en laat de glijbanen 5 minuten in watervrije ethanol weken zodra de gemonteerde secties volledig zijn opgedroogd.
Vervolgens weken de glijbanen in xyleen gedurende 10 minuten en verzegelen ze met een geschikte montage medium. Beeld vervolgens de dia's met een lichtmicroscoop uitgerust met een lading gekoppeld apparaat op 100, 200, en 400 keer vergrotingen. eGFP immunostaining van cervicale en lumbale dwarslaesieweefsel secties onthult weinig of geen transductie in het lumbale ruggenmerg van muizen met een zwakte score van 0, licht verbeterde transductie bij muizen met een zwakte score van 1, en sterke en wijdverspreide transducties bij muizen met een zwakte score van 4 of 5.
Kwantificering van de GFP-kleurintensiteit van dwarslaesie van dwarslaesie van muizen met verschillende gradaties van voorbijgaande ledematen, geeft aan dat de ernst van de zwakte na de injectie met virusoplossing nauw correleert met de omvang van de dwarslaesie. In de hersenen worden robuuste eGFP-signalen gedetecteerd in de olfactorische bol, dorsolaterale prefrontale cortex, dentate gyrus en de CA3-zone van de hippocampus, cerebellaire cortex en marginale gebieden van de hersenstam, waaronder de gezichtskern, choroid plexus en de ependymale epitheliale cellen. Motorneuronen in de voorste hoorns worden ook sterk omgezet in verschillende niveaus van het ruggenmerg.
Bovendien, in de cortex, GFP positieve neuronen met inbegrip van piramidale cellen worden gedetecteerd, evenals verschillende glia celtypes, waaronder microglia, astrocyten, en oligodendrocyten. Deze techniek stelt onderzoekers in de neurologie veld in staat om de therapeutische effecten van directe intrathecale levering bij kleine wakkere dieren op ziekten van het centrale zenuwstelsel te verkennen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
