Neuroscience
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Direct Injection intrathécale de Recombinant Adeno-associated virus chez la souris adulte
Chapters
Summary February 15th, 2019
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Nous présentons une technique d’injection intrathécale directe à l’aide de chlorhydrate de lidocaïne 1 % dans une solution virale pour assurer une prestation efficace virus adeno-associé à de petits animaux et de mettre en place un système de notation pour prédire l’efficacité de la transduction du central système nerveux selon le degré de faiblesse transitoire induit par la lidocaïne.
Transcript
Cette méthode facilite la livraison intrathécale efficace des transgènes viraux adéno-associés chez les petits animaux éveillés pour le traitement expérimental des maladies du système nerveux central telles que la SLA. Le principal avantage de cette méthode est que la solution virale comprend 1% d’hydrochlorure lidocaïne qui induit une paralysie transitoire après une injection réussie. Bien que cette méthode fournisse un indicateur visuel pour juger du succès de la situation automatisée intrathécale, une pratique suffisante est essentielle pour améliorer le taux de réussite de la livraison.
Avant de commencer l’intervention, fixez une aiguille de calibre 27 à une seringue Hamilton de 25 microlitres et alignez l’extrémité biseauté de l’aiguille avec l’échelle volumétrique sur la seringue. Ensuite, chargez soigneusement 8 microlitres de 4 x 10 à la 10e copie du génome de la solution virale dans la seringue, en prenant soin d’éviter les bulles. Ensuite, placez une souris éveillée de 30 à 70 jours de 12 à 30 grammes sur un morceau de lit en position couchée dans une hotte de biosécurité et couvrez le haut du corps avec de la gaze stérile pour calmer la souris et éviter d’être mordu.
Agripper fermement la souris sur sa ceinture pelvienne avec le pouce d’un côté et l’index et le majeur de l’autre côté en gardant la peau entre les ceintures pelviennes bilatérales tendues avec un pouce et un index. Ensuite, rasez la fourrure entre les ceintures pelviennes bilatérales et stérilisez la peau exposée avec un gommage à base d’iode et 70% d’éthanol. Pour la livraison intrathécale directe de la solution de virus adéno-associée, palpez l’espace intervertébral le long de la ligne médiane entre les ceintures pelviennes bilatérales et utilisez un ongle pour déprimer une indentation dans la peau pour indiquer l’espace intervertébral L5 à L6.
Faites pivoter légèrement et doucement la base de la queue pour révéler la ligne médiane de la colonne vertébrale et ajuster le biseau de l’aiguille vers la tête de l’animal. Avec la souris fixée fermement en position, aligner l’aiguille le long de la ligne médiane de la colonne vertébrale et insérer l’aiguille doucement et verticalement dans le centre de l’indentation en gardant la seringue dans un plan sagittal central. Lorsque l’aiguille entre en contact avec l’os, diminuez lentement l’angle à environ 30 degrés et glissez l’aiguille dans l’espace intervertébral.
Un coup de queue soudain est le signe d’une entrée réussie dans l’espace intradural. Lorsque l’aiguille entre dans l’espace intervertébral, la pointe se sent fermement serrée. Injectez la solution vectorielle et maintenez l’aiguille dans l’espace intradural pendant une minute.
Retirez ensuite lentement l’aiguille avec rotation pour minimiser les fuites. Marquez immédiatement la faiblesse transitoire des membres de la souris pour évaluer la qualité de l’injection et retourner la souris dans sa cage pour se remettre de la paralysie. Au point de terminaison expérimental approprié, fixez les membres et la tête de la souris injectée en position couchée sur un couvercle de boîte en mousse et utilisez des ciseaux pour dépouiller et enlever la peau de la tête au sacrum.
Couper le crâne entre les yeux, couper le long de la ligne médiane du crâne et la ligne horizontale au-dessus du cervelet et ouvrir le crâne de chaque côté. Utilisez des pinces à épiler pour enlever l’os occipital et utilisez des ciseaux ophtalmiques pour ouvrir le canal rachidien bilatéralement. Couper les côtes des deux côtés et retirer délicatement la partie supérieure des vertèbres.
Utilisez des pinces courbes pour soulever le cerveau et couper les nerfs de la base du crâne. Puis extraire soigneusement tout le cerveau et la moelle épinière et fixer les tissus en paraformaldéhyde 4% pendant 24 heures. À la fin de la période de fixation, cryoprotect le cerveau et la moelle épinière cervicale et lombaire dans la solution de saccharose de 30% pendant la nuit à 4 degrés Celsius suivie de l’intégration dans le composé optimal de température de coupe avant de casser le gel dans l’azote liquide.
Ensuite, utilisez un cryostat pour obtenir 25 micromètres d’épaisseur sections de chaque tissu, le stockage des sections congelées en 0,01 molaire PBS à 4 degrés Celsius comme ils sont obtenus. Pour l’analyse immunohistochimique des tissus, prétraiter les sections flottantes libres avec 1% de peroxyde d’hydrogène pendant 10 minutes suivie d’un lavage de 10 minutes en PBS. Ensuite, incuber les échantillons dans la solution de blocage contenant 5% sérum et 0,3% détergent non ionique dans PBS pendant 1 heure suivie de l’étiquetage de nuit à 4 degrés Celsius avec les anticorps primaires appropriés d’intérêt.
Le lendemain, lavez les sections avec 3 lavages de 10 minutes en PBS plus Tween et incubez les toboggans avec les anticorps secondaires biotinylés correspondants appropriés à température ambiante pendant 1 heure après le dernier lavage. À la fin de l’incubation, lavez les sections 3 fois en PBST frais comme vous venez de le démontrer et incubez les échantillons avec un complexe infini de peroxyde de biotine pendant 40 minutes, suivi d’une coloration avec un agent chromogène approprié. Montez les sections étiquetées sur des glissières de microscope en verre et trempez les glissières dans de l’éthanol anhydre pendant 5 minutes une fois que les sections montées ont complètement séché.
Ensuite, tremper les toboggans dans du xylène pendant 10 minutes et les sceller avec un milieu de montage approprié. Puis imagez les diapositives avec un microscope léger équipé d’un dispositif couplé de charge à 100, 200, et 400 fois grossissements. L’immunostaining d’eGFP des sections cervicales et lombaires de tissu de moelle épinière indique peu ou pas de transduction dans la moelle épinière lombaire des souris avec un score de faiblesse de 0, transduction légèrement augmentée chez les souris avec un score de faiblesse de 1, et transductions fortes et répandues chez les souris avec un score de faiblesse de 4 ou 5.
La quantification de l’intensité de coloration de GFP des sections de tissu de moelle épinière des souris affichant divers degrés de faiblesse transitoire de membre indique que la sévérité de la faiblesse après injection de solution de virus corréle étroitement avec l’ampleur de la transduction de moelle épinière. Dans le cerveau, des signaux eGFP robustes sont détectés dans le bulbe olfactif, le cortex préfrontal dorsolateral, le gyrus bosselé, et la zone CA3 de l’hippocampe, du cortex cerebellar, et des secteurs marginaux du tronc cérébral, y compris le noyau facial, le plexus choroïde, et les cellules épithéliales épendymales. Les neurones moteurs dans les cornes antérieures sont également fortement transduced dans différents niveaux de la moelle épinière.
En outre, dans le cortex, des neurones positifs de GFP comprenant des cellules pyramidales sont détectés aussi bien que divers types de cellules gliales comprenant des microglies, des astrocytes, et des oligodendrocytes. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de la neurologie d’explorer les effets thérapeutiques de l’accouchement intrathécal direct chez les petits animaux éveillés sur les maladies du système nerveux central.
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