Nowa prosta metoda pomiaru lipofilowości (log<em>P</em>) przy użyciu spektroskopii ¹⁹F NMR

Lipofilowość to kluczowy parametr fizykochemiczny cząsteczek leku, który wpływa na właściwości kandydatów na leki w wielu aspektach, w tym rozpuszczalności leku, biodostępności i toksyczności¹. Lipofilowość mierzy się jako logarytm (logP) stosunku stężeń związków po rozdzieleniu między n-oktanolem a wodą. Optymalne zakresy lipofilowości zostały zaproponowane na podstawie danych statystycznych leków podawanych doustnie, z których najsłynniejszym przykładem jest "reguła 5" Lipińskiego^2,3. Rzeczywiście, kontrolowanie lipofilowości okazało się niezbędne dla poprawy perspektyw kandydatów na leki. Zwiększenie powinowactwa wiązania leków poprzez podwyższoną lipofilowość zostało zidentyfikowane jako jeden z głównych problemów w projektach odkrywania leków w ciągu ostatnich kilku dekad, prowadząc do zwiększonych wskaźników wyczerpania³. W związku z tym zasugerowano, że pomyślne opracowanie leku wiąże się z utrzymaniem lipofilowości molekularnej kandydatów na leki w optymalnych granicach podczas procesu optymalizacji powinowactwa^3,4. W związku z tym wprowadzono nowe koncepcje (takie jak wskaźniki efektywności lipofilowej)^5,6.

Dlatego bardzo ważne jest dokładne zmierzenie lipofilowości podczas procesu opracowywania leku. Poza tym istnieje zapotrzebowanie na dostępność prostych metod pomiaru lipofilowości, ponieważ badania podstawowe mają na celu zidentyfikowanie rozwiązań dla modulacji logarytmuP. Obecnie dostępnych jest wiele uznanych metod oznaczania lipofilowości¹. Standardowa metoda 'shake-flask (SF)'⁷i jej odmiany są powszechnie stosowane do bezpośredniego pomiaru wartości logarytmuP, które w większości przypadków zależą od spektroskopii UV-Vis w celu określenia ilościowego. Główną wadą tej klasycznej metody SF jest jej pracochłonny charakter. Ponadto może dojść do tworzenia emulsji, szczególnie w przypadku związków silnie lipofilowych^8,9. Opracowano kilka metod obejścia takich problemów, takich jak analiza wtrysku przepływowego, rurki do dializy itp. ⁹,¹⁰. Jednak żadna z tych metod nie jest prosta ani łatwa do zastosowania w niewyspecjalizowanych laboratoriach.

Istnieje również wiele metod pośrednich dostępnych do użycia, takich jak miareczkowanie potencjometryczne¹¹, metody elektroforetyczne^12,13, metody chromatograficzne oparte na RP-HPLC, metody oparte na spektrometrii mas¹⁴, itd. Są to metody pośrednie, ponieważ wartości logarytmuP uzyskuje się za pomocą krzywych kalibracyjnych. Wśród tych metod metoda RP-HPLC jest szeroko stosowana, ponieważ jest przyjazna dla użytkownika i oszczędza czas. Niemniej jednak jego dokładność zależy od zestawu treningowego użytego do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej, a szacowana lipofilowość zależy od zastosowanego systemu partycji^13,15.

W literaturze opisano wiele metod określania lipofilowości opartych na 1 H NMR. Mo i wsp. opracowali metodę pomiaru logarytmuP przy użyciu ¹H NMR bez deuterowanych rozpuszczalników. Woda i oktanol, jako rozpuszczalniki podziału podziału, zostały użyte jako odniesienia do ilościowego określenia stężenia substancji rozpuszczonej w każdej fazie¹⁶. Herth i współpracownicy opisali również podejście, w którym eksperyment z podziałem przeprowadzono bezpośrednio w probówce NMR, gdzie dane NMR dolnej warstwy wodnej D₂O zostały zebrane przed i po ekstrakcji 1-oktanolem, aby uzyskać współczynnik dystrybucji¹⁷. Ponadto Soulsby i in. wykorzystali ¹H NMR jako narzędzie analityczne, określając amplitudę sygnałów za pomocą oprogramowania do pełnej redukcji do tabeli amplitudy i częstotliwości. Stosunek amplitud w obu warstwach doprowadził do zmierzonego współczynnika podziału¹⁸. Metody te są stosunkowo proste w użyciu, ale często wymagają kalibracji selektywnych impulsów i poziomów mocy lub użycia kształtowych impulsów gradientowych w celu zapewnienia odpowiedniego tłumienia rozpuszczalnika i selektywności sygnału.

Obliczone wartości logarytmuP (zatkaniaP) dla związków mogą być również uzyskane. Dostępnych jest kilka metod obliczeniowych i dostępne na rynku oprogramowanie. Takie zatkane wartościP są powszechnie stosowane w przemyśle farmaceutycznym przy ocenie dużej liczby cząsteczek leków. Jednak duże błędy wynikające z zatkanych wartościP nie są rzadkością^19,20.

Wymagania dotyczące aktywności UV do analizy stężenia i ustanowienie krzywych kalibracyjnych do obliczania logarytmuP hamują postęp badań w tej dziedzinie. Dotyczy to w szczególności związków alifatycznych nieaktywnych w promieniowaniu UV. Fluorowane ugrupowania alifatyczne stają się w ostatnich latach coraz bardziej atrakcyjne dla projektowania leków, a ich wpływ na ogólną lipofilowość związku jest tematem badawczym w naszej grupie²¹. Ponadto ¹⁹F jest bardzo czułym jądrem aktywnym NMR, co sprawia, że ¹⁹F NMR jest użytecznym narzędziem do analizy związków fluorowanych. Ma również większy zakres przesunięcia chemicznego w porównaniu do ¹H. Dlatego warto opracować prostą metodę oznaczania logarytmuP nieaktywnych w promieniowaniu UV związków fluorowanych metodą spektroskopii ¹⁹F NMR. W związku z tym ogólnym celem tej metody jest uzyskanie wygodnego oznaczania lipofilowości związków fluorowanych.

Kluczową zasadą naszej metody opartej na ¹⁹F NMR jest dodanie fluorowanego związku referencyjnego w eksperymencie partycji (Rysunek 1)²¹. Związek X i związek odniesienia (ref) są podzielone między wodę i n-oktanol. Po zrównoważeniu podwielokrotność z każdej fazy jest pobierana do probówki NMR i przeprowadza ^{się 19}eksperymentów F NMR na obu próbkach NMR. Intensywność pików fluoru jest proporcjonalna do stężenia związku (C) i liczby atomów fluoru (n) w związkach. Pomiędzy związkiem X i ref można uzyskać stosunki całkowe dla obu faz. Stosunek w warstwie n-oktanolu definiuje się jako ρ_okt, a ρ_aq dla warstwy wody (równanie 1). Stosunek wartości ρ jest równy stosunkowi współczynników podziału (P) związku X i ref (równanie 2). Prowadzi to do końcowego równania (równanie 4) dla pomiaru logarytmuP związku X. Dlatego, aby określić wartość logarytmuP nieznanego związku X, za pomocą ¹⁹F NMR należy zmierzyć tylko współczynniki całkowania (ρ_oct i ρ_aq) w obu warstwach.