Login processing...

JoVE Journal
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Biochemistry

Kristallstrukturen av N-terminala domänen av ryanodinreceptorn från Plutella xylostella

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Journal (Biochemistry)

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Journal (Biochemistry)

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

Click here for the English version

Kristallstrukturen av N-terminala domänen av ryanodinreceptorn från Plutella xylostella

Article DOI: 10.3791/58568-v

November 30th, 2018 •

Bidhan Chandra Nayak*¹, Jie Wang*¹, Lianyun Lin*^1,2,3,4, Weiyi He^2,3,4, Minsheng You^2,3,4, Zhiguang Yuchi^1,2

¹Tianjin Key Laboratory for Modern Drug Delivery & High-Efficiency, Collaborative Innovation Center of Chemical Science and Engineering, School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, ²State Key Laboratory of Ecological Pest Control for Fujian/Taiwan Crops and Institute of Applied Ecology, Fujian Agriculture and Forestry University, ³Joint International Research Laboratory of Ecological Pest Control, Ministry of Education, Fuzhou, ⁴Fujian-Taiwan Joint Centre for Ecological Control of Crop Pests, Fujian Agriculture and Forestry University

* These authors contributed equally

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

November 30th, 2018

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

I den här artikeln beskriver vi protokoll av protein uttryck, rening, kristallisering och struktur bestämning av N-terminala domänen för ryanodinreceptorn från diamondback moth (Plutella xylostella).

Transcript

Att lösa strukturen hos ryanodine-receptordomänen kan hjälpa till med vår förståelse av den molekylära mekanismen hos proteinfunktionen, insekticid-verkan och insekticidresistensutveckling. Detta mäter antyder bruket av röntgenkristallografi för strukturerar illustration, som är ansedd en guldmyntfot för protein strukturerar beslutsamhet på near-atomic upplösning. Denna högupplösta struktur av insekten ryanodine receptor domän avslöjar mekanismen för kanal gating och ger en viktig mall för utveckling av artspecifika insekticider med hjälp av struktur-baserade metoder läkemedelsdesign.

Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa, eftersom blivande protein kristallografer måste vara skickliga i biokemi, biofysik, datavetenskap och matematik. Börja med att förstärka DNA som motsvarar proteinet av intresse genom polymeras kedjereaktion. I slutet av reaktionen, kör hela 50 mikroliter av reaktion mix på en 2%agaros gel, och extrahera DNA med en gel extraktion kit enligt standardprotokoll.

Därefter linjäriserar LIC-vektorns DNA genom att blanda 20 mikroliter av vektorndna med 6 mikroliter av 10X-reaktionsbuffert och 4 mikroliter av SspI-restriktionsenzym i 30 mikroliter av dubbeldestillerat vatten. Inkubera denna reaktionsblandning i tre timmar vid 37 grader Celsius. I slutet av inkubationen, kör hela reaktionsmixen på en 1%agarosgel, följt av extraktion av det linjäriserade vektor-DNA med en gelextraktionssats enligt tillverkarens anvisningar.

Därefter utför separata T4 DNA-polymeras behandlingar på 5 mikroliter av den linjäriserade vektornDNA och PCR förstärkt infoga DNA, enligt standardprotokoll. Inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur, följt av 20 minuters enzymvärme inaktivering vid 75 grader Celsius. Utför den ligeringsoberoende kloningsglödgningsreaktionen genom att kombinera 2 mikroliter av det T4-behandlade instudet DNA med 2 mikroliter av det T4-behandlade LIC-vektor-DNA för en 10 minuters inkubation vid rumstemperatur.

För att omvandla BL21(DE3)E. Coli celler med rekombinant plasmid, tina 50 mikroliter av kompetenta celler på is, och tillsätt cirka 1 mikroliter av den glödgade plasmid till röret. Snärta försiktigt röret två till tre gånger för att blanda cellerna och DNA, och placera röret tillbaka på is i 20 minuter.

I slutet av inkubationen, värme-chock cellerna på 42 grader Celsius i 40 sekunder, följt av två minuter tillbaka på is. Lägg därefter till en milliliter av rumtemperatur LB-medium till röret, och placera cellerna på en 250 RPM shaker i 45 minuter vid 37 grader Celsius. I slutet av skakningen inkubation, platta 150 till 200 mikroliter av denna blandning på urval plattor, och invert plattorna över natten vid 37 grader Celsius.

Nästa dag, kultur en enda koloni i 100 milliliter av 2-YT medium, kompletterad med kanamycin, i en shaker inkubator på 37 grader Celsius över natten. Nästa morgon, inokulera en liter 2-YT medium, kompletteras med kanamycin, med 10 milliliter av natten kultur, och inkubera vid 37 grader Celsius med skakning tills OD600 behandlingen når cirka 0,6. Sedan, inducera kulturen med IPTG till en slutlig koncentration av 0,4 millimolar, och odla cellerna i fem timmar vid 30 grader Celsius.

Vid slutet av inkubationen, skörda cellerna genom centrifugering, och åter upphäva pelleten till en 10 gram bakterier per 40 milliliter av lys buffertkoncentration. Störa cellväggarna genom ultraljudsbehandling vid en 65%amplitud, och en sekund på en sekund av, i åtta minuter. Ta bort cellskräpet genom centrifugeringen.

Filtrera sedan supernatanten genom ett 22-mikrometerfilter och ladda lösningen i en provslinga. För att rena fusionsproteinet injicerar du den filtrerade supernatanten från provslingan i en fem milliliter nickel-nitrolotriatisk kolonn på ett reningssystem med en linjär gradient på 20 till 250 millimolar imidazol. Cleave eluted målprotein med tobak etch virus proteas, vid en 1-till-50 förhållande, över natten vid 4 grader Celsius, och rena klyvning reaktionsblandningen på en amylos harts kolumn, och en nickel-nitrolotriacetic kolumn, för att ta bort taggen och tobak etch virus proteas.

Dialysa genomflödet från nickel-nitrolotriacetiska kolonnen mot dialysbuffert för att minska saltkoncentrationen, och rena provet på en anjonutbyteskonar med en linjär gradient på 20 till 500 millimolär kaliumklorid i elutionsbufferten. Koncentrera sedan proteinet i en centrifugalkoncentrator. Injicera det koncentrerade proteinet i en Superdex 200 26/600 gelfiltreringskolumn för att kontrollera homogeniteten, och bedöm proteinens renhet med 15%SDS-PAGE.

För att förbereda proteinet för kristallisation, koncentrera det renade proteinprovet till 10 milligram per milliliter i centrifugalkoncentratorn, och buffertutbyte till kristalliseringsbuffert före 80 grader Celsius lagring. För att utföra kristallisering screening, använd den sittande metoden drop vapor diffusion på 295 Kelvin, med flera kristallisering kit, och en automatiserad vätskehantering system i en 96-brunn format. I slutet av droppinställningen förseglar du 96-brunnskristalliseringsplattan för att förhindra avdunstning, och för att möjliggöra jämvikten av proteindroppningen inom reservoarbufferten.

Placera plattorna i en kristall inkubator på 18 grader Celsius. Kontrollera plattorna periodiskt under ett lätt mikroskop för att övervaka kristallbildningen och tillväxten. För att skilja proteinkristallerna från saltkristallerna, tillsätt en mikroliter proteinkristallfärg till målet droppe, och observera kristallerna under mikroskopet efter en timme.

Proteinkristallerna kommer att verka blå. För att ytterligare optimera kristallerna, använd de positiva kristalliseringsförhållandena och metoden med hängande droppångdiffusion i 24-brunnsplattor, följt av inkubation i kristallinkubatorn vid 18 grader Celsius. För att bestämma proteinstrukturen monterar du kristallerna på en kryoslinga under ett ljusmikroskop för blixtkylning i flytande kväve, och placera kristallerna i en unibuck för lagring och transport.

För-skärm kristallerna i en in-house röntgen diffractor, med hjälp av den manuella centrering funktion för att montera och centrera kristallerna. Sedan använder du programvaran för röntgendiffraktion för att samla in data. För att indexera, integrera och skala datamängden, med HKL-2000-svit, först, välj detektor och ladda datamängden.

Sedan, utföra topp sökfunktionen för att hitta diffraktion fläckar. Indexera fläckarna, välj rätt utrymmesgrupp och utför toppintegration. Därefter skalar du datauppsättningen.

Justera felmodellen och skalan igen. Spara utdata sca-filen. För att bestämma strukturen med hjälp av Phenix software suite, skapa ett nytt projekt.

Kör först Extriage med sca-filen för att beräkna det möjliga kopieringsnumret av proteinmolekyler i den asymmetriska enheten. Nästa, för att lösa fas problemet genom molekylär ersättning, kör Phaser, med hjälp av diffraktion datafilen, mallen strukturfilen med hög sekvens identitet och strukturell likhet som målprotein, och proteinsekvensfilen, att hitta lösningen. Utför auto-build i Phenix för att generera den initiala modellen, med hjälp av utdatafilen från Phaser och sekvensfilen från målproteinet.

Bygg strukturen manuellt in i den modifierade experimentella elektrontätheten med hjälp av COOT, och förfina med hjälp av Phenix förfina i iterativa cykler. Validera den slutliga modellen med hjälp av valideringsverktygen i Phenix. I detta representativa experiment, rening av slutet-terminal domänen av diamondback moth ryanodine receptor protein, som visat, gav ett enda band på cirka 21 kilodalton genom STS-PAGE analys.

Elueringsvolymen från gel filtrering kolumnen bekräftade den renade ryanodine receptorn end-terminal domän att vara en monomer. För kristallisering, de mest optimala förhållanden under vilka högkvalitativa plattan-formade kristaller bildades var i närvaro av 1 molar HEPES av ett pH-värde på 7, och 1,6 molar ammoniumsulfat. Bestämning av proteinstrukturen från diffraktion datamängden utnyttja mjukvaror som visats avslöjade diamondback moth ryanodine receptor slutet-terminal domän som täcker rester 1 genom 205.

Proteiner med stor oordning, flexibla regioner, eller med svag affiniteter är utmanande att kristallisera. I dessa scenarier, protein engineering strategier såsom ytan entropi minskning, loop trunkering, och tvärbindning, kan öka sannolikheten för att få bättre proteinkristaller. Förutom att avslöja högupplösta proteinstrukturer kan röntgenkristallografi också användas för att studera interaktioner mellan protein och bekämpningsmedel, vilket kan hjälpa till med strukturbaserad bekämpningsmedelsdesign.

X

Simple Hit Counter