Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Analyse af Actomyosin dynamik på lokale cellulære og vævs skalaer ved hjælp af time-lapse film af dyrkede Drosophila ægge kamre
Chapters
Summary June 3rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol giver en Fiji-baseret, brugervenlig metode sammen med ligetil instruktioner, der forklarer, hvordan man pålideligt analysere actomyosin adfærd i individuelle celler og buede epiteliale væv. Ingen programmering færdigheder er forpligtet til at følge tutorial; alle trin udføres på en semi-interaktiv måde ved hjælp af den grafiske brugergrænseflade af Fiji og tilhørende plugins.
Transcript
Vores protokol hjælper forskere til at analysere subcellulære actomyosin netværk i de enkelte epitelceller og giver dem også mulighed for at udføre lignende analyse på multicellulær skala i buede epitelvæv. Vores protokol er et godt eksempel på en Fiji ansøgning. Det har en intuitiv grafisk brugergrænseflade, og det kræver ikke nogen viden om scripting.
Derfor er det meget velegnet også til nybegyndere i marken. Selv om vores metode blev udviklet til Drosophila æg kamre, det gælder også uden Drosophila epithelia. Vi opfordrer forskere til at teste vores protokol i deres modelsystemer.
Brug de ledsagede testfiler til at blive fortrolig med denne protokol. Det vil hjælpe dig med at beslutte, hvilken del af denne protokol der er egnet til dit individuelle forskningsspørgsmål. Denne del af protokollen giver brugerne mulighed for at segmentere epitelceller i time-lapse-film og efterfølgende analysere actomyosinimpulser i individuelle celler over tid ved hjælp af Surface Manager.
Til at begynde, åbne Fiji og importere makroen TissueCellSegmentMovie. som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Åbn derefter en blegemiddelkorrigeret TIFF-fil, og opdel kanalerne i den blegemiddelkorrigerede fil ved at gå til menulinjen, vælge Billede efterfulgt af Farve og vælge Split Channels.
Kør det overførte script på den aktive cellemembrankanal i den valgte time-lapse-film ved at trykke på ikonet Kør i det åbne script. For at få en flot cellemaske skal du indstille gaussisk sløring til 2.500 og celledetektionsfølsomhed til minus en, og klik på OK. Derefter skal du indstille den anslåede støjtolerance mellem 10 og 20 for time-lapse-film, der er anskaffet med 63x-målet, og klik på OK. Der vises en genereret cellemaske i den analyserede time-lapse-film, et nyt vindue med titlen ParticleStack vises, og der vises også et lille vindue med titlen Handling, der kaldes Handling påkrævet. Fra cellemasken på time-lapse-filmen skal du kun fokusere på celler i midten og vælge dem, der kan give komplette og veldefinerede konturer i hele time-lapse-filmen.
Når de markerede celler i midten svarer pænt til de rigtige cellemembraner, skal du gemme ParticleStack som en TIFF-fil. Åbn den tilsvarende ParticleStack TIFF-fil i Fiji. Når Surface Manager-plugin'et er installeret i Fiji, skal du åbne plugin'et.
Klik på knappen Læs dispositionsbillede i Surface Manager, og angiv Jaccard-indekset til 60 %Indlæsning af konturerne kan tage flere minutter afhængigt af antallet af celler. Når hver celle er indlæst, tildeles den et S-nummer og vises i venstre del af Surface Manager-vinduet. Klik på det valgte S-nummer, så den importerede cellekontur fra ParticleStack1.
tiff vises på time-lapse-filmen. Kontroller hvert importeret S-nummer for celledispositionskvalitet i hele filmen, og fjern uønskede celler, der viser forkerte cellekonturer. Hvis du vil fjerne en uønsket celle, skal du markere cellekonturen og klikke på knappen Slet.
Brug penselværktøjet til at korrigere cellekonturer. Når du er færdig, skal du gemme de korrigerede celler som et RoiSet. zip-fil.
At identificere, om actomyosin pulser er til stede i det analyserede væv og til at forstå den detaljerede adfærd, samt directionalitet af actomyosin signaler, begynde med at åbne Fiji. Åbn en time-lapse film, indlæse de gemte ParticleStack1. tiff-cellemaske og den blegemiddelkorrigerede time-lapse-film, og indlæs derefter Surface Manager-plugin'et og det tilsvarende interesseområde fra RoiSet.
zip-fil. Derefter skal du aktivere en kanal med interessesignaler i Surface Manager. Klik på knappen Statistik for at hente vinduet Med den gennemsnitlige grå værdi Udsnit efter udsnit.
Middelintensiteten og medianintensiteten af actomyosinsignalerne vises over tid i vilkårlige enheder samt andre parametre relateret til cellens område og form. Gem værdierne som en regnearksfil ved at gå til vinduet Statistik, klikke på Filer og vælge Gem som.lignende, oprette en cellemaske og indlæse den i Surface Manager for at analysere actomyosinimpulser på vævsskalaen. Denne del af protokollen giver brugerne mulighed for selektivt at udtrække et tyndt lag af actomyosin i det buede epitelvæv over tid.
Disse trin er brugervenlige og baseret på en intuitiv grafisk brugerflade. Åbn Fiji, og sørg for, at Ellipsoid Surface Projection plugin er installeret. Åbn derefter en time-lapse-film, og eksportér den som en XML/HDF5-fil ved at klikke på Plugins, gå til BigDataViewer og vælge Export Current Image as XML/HDF5-fil.
Åbn derefter den eksporterede fil i Ellipsoid Surface Projection ved at gå til Plugins, klikke på BigDataViewer efterfulgt af Ellipsoid Surface Projection og vælge XML-fil. Dette vil åbne et nyt vindue med sagittal visninger af æggekammeret, og en dialog til at guide brugeren gennem forarbejdning vises. Dialogvinduet, kaldet Æggestokkene Projection, har flere faner.
I den første dialogfane, kaldet afgrænsningsboks, skal du definere x- og y-kanterne for et ægkammer i time-lapse-filmen sammen med z-bredden på afgrænsningsboksen, og tryk på sæt. De udvalgte dele af æggekammeret er fremhævet med pink. Derefter skal du definere størrelsen på signalblytter i dialogfanen kaldet finde klatter i vinduet Ovarieprojektion.
Definer sigma og den minimale spidsværdi. Tryk derefter på beregne for at identificere actomyosin-signalerne, der vises som grønne klatter. Prøv dette trin igen med forskellige parametre, indtil der findes omkring 100 pladser.
Identifikation af actomyosin signaler er et afgørende skridt. Det afhænger af signalkvaliteten og den korrekte størrelse af de registrerede klatter. Hvis der ikke er synlige grønne pletter i billedet, vil det næste trin ikke fungere.
For at designe ellipseformet, fortsætte med fanen kaldet fit ellipsoid. Indstil tilfældige stikprøver til 10.000, den udvendige/indvendige afskæringsafstand til en til 10, og klik derefter på beregn. Derefter åbnes fanen kaldet projektion automatisk og giver mulighed for definition af overfladeudsugning.
Under projektionsfanen skal du oprette en minimums- og maksimumprojektionsafstand som bredden på den ønskede ellipseform. Den minimale og maksimale projektionsafstand skal passe, så det lyserøde definerede ellipseformede område omfatter hele æggekammerets udvendige lag. Definer derefter udsnitsafstanden som én.
Sørg for, at den lyserøde region af ellipseformet med den definerede med på æggekammeret er synlig, før du trykker på beregning. Det hjælper til at vurdere kvaliteten af en ny ellipseformet pasform. Derefter skal du indstille en udgangsbredde på ellipseformen til større end eller lig med 800 og en højde, der er større end eller lig med 400.
Derefter indstille varigheden af overfladen ekstraktion, og vælg enten en sfærisk eller en cylindrisk projektion. Hvis det er nødvendigt, skal du spejlvende Z og justere Y.Press-beregning for at opnå en overfladeudtrækning for begge kanaler i nye vinduer kaldet billede. Juster lysstyrken og kontrasten i de opnåede billedvinduer for at kunne se de projicerede actomyosin-signaler ved at klikke på Billede, justere og vælge Lysstyrke/kontrast.
Hvis overfladeudsugningen ser godt ud, skal du gemme begge kanaler separat som TIFF-filer. Derudover skal du gemme logvinduesfilen til senere brug af, hvordan overfladen af dette ægkammer blev ekstraheret. Derefter flette kanalerne med en foretrukken farvekode i Fiji, og gemme resultaterne som TIFF-filer.
Denne protokol gør det muligt for forskere at undersøge adfærd actomyosin netværk i epitelvæv. Dette er kun muligt, når en detaljeret analyse af actomyosin adfærd på den lokale cellulære skala er kombineret med en lignende analyse på vævsskalaen. Vist her er repræsentative eksempler på dynamisk myosin II adfærd på den lokale cellulære skala og på væv skala for kontrol og fat2 mutant Drosophila æg kamre.
På det basale enkelt plan bevæger den grønne modificerede regulerende lyskæde af myosin II-signaler vinkelret på den forreste bageste akse af kontrolægkamre. Denne polaritet går tabt i fat2 mutant æg kamre og fører til anisotropiske myosin II pulser, svingninger På vævsniveau, den grønne modificerede regulerende lyskæde af myosin II i kontrolprøven genererer synkroniseret kraft, der kræves for at fremme epitelrotation. I modsætning hertil follikel epitel af en fat2 mutant æg kammer puls kraftigt på basal side og undlader at generere den synkroniserede kraft, der kræves for at fremme epitelrotation.
I en tynd apikale region i Drosophila æg kammer, fat2 mutant præsenterer også med ændret dynamisk adfærd af den grønne modificerede regulerende lyskæde af myosin II.After at have set denne video, bør du have en god idé om, hvordan man analyserer en actomyosin netværk på lokalt og væv skala i Drosophila æg kamre ved hjælp af Fiji. Yderligere praktiske tip og fejlfinding finder du i diskussionsdelen efter protokollen. Hvis du har spørgsmål relateret til Fiji eller vores plugins, se de respektive websider eller kontakt os.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
