Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ביטוי עצמאי מתנול Pichia Pastoris דה-דיכוי בטכנולוגיות
Chapters
Summary January 23rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
שיטה זו בפעם הראשונה מתאר אמין הליכים ניסיוני לייצור חלבון רקומביננטי ללא מתנול inducible יעיל Pichia pastoris (Komagataella phaffii), העסקת היזמים מקור מוסדר פחמן P DCו- PDF בניסויים בקנה מידה קטן תוך טיפוח פרמטרים ניתן לנטר באופן מקוון, והיא מיושמת הזנה מתמדת גליצרול.
Transcript
שיטה זו יכולה לעזור בבחירה המוקדמת של שיבוטי כרומוזומים על ידי זני פישיה פסטוריס המבטאת חלבונים רקומביננטיים בתנאים מודחקים על ידי טיפוח בקבוקון שייק פשוט לפני קנה המידה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי ביטוי חלבון חופשי מתנול ברמה גבוהה ניתן להשיג באמצעות פסטוריס פיצ'יה, אשר נתמך על ידי ניטור מקוון מדויק של פרמטרים חשובים טיפוח. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק כי נקודת הזמן להתחלת זכוכית לגדול להאכיל צריך להיות מותאם מאפייני הצמיחה של זן הייצור הספציפי.
לפני הקמת התרבות העיקרית, זרע מושבה טרייה אחת של זן הביטוי של עניין לתוך 5 מ"ל של מרק פפטו ודקסטרוז שמרים בצינור חרוט 50 מ"ל. השאירו את המכסה מעט פתוח כדי לאפשר איום נאות. מ- Than, מקם את התרבות בשייקר בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, 80% לחות ו-100 עד 130 סל"ד למשך הלילה.
למחרת בבוקר להפעיל את התוכנה לחיבור ההתקנים באמצעות Bluetooth. לאחר מכן, לחץ על כפתור הכסף בחלק הקדמי של התקן המדידה ביומסה כדי להפעיל את חיבור Bluetooth למכשיר ולחץ על למצוא התקנים בתוכנת ניטור המחשב. גרור ושחרר את ההתקנים שנמצאו לריבועים במגש המדידה ולחץ על התחבר.
בעת חיבור מוצלח, יופיע מסך בקרה. כדי להגדיר ניסוי, לחץ על התחל מדידה. תן שם לניסוי ובדוק אם כל הפרמטרים הדרושים לניטור זמינים.
הגדר את המרווח לשלוש דקות ואת נקודות המדידה הממוצעות ל- 11. הזינו את השמות לדגימות ודלגו על כיול הזווית. למדוד את צפיפות התא של תרבות הלילה מדולל ביחס של 1 עד 20 במדיום טיפוח בספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.
לחסן 50 מ"ל של המדיום עם תרבות הלילה כדי OD 600 של 05. מ, מניחים את flasks בגלאים ב 28 מעלות צלזיוס, 130 סל"ד ו 80% לחות במשך חמש דקות. לחץ על התחל מדידה בתוכנה.
ארבע שעות לאחר החיסון, השתמש מדגם 2 מ"ל למדידת צפיפות התא כפי שהודגם רק. כאשר ריכוז החמצן מתקרב לאפס והתאים נמצאים בשלב הצמיחה המעריכית מוסיפים ארבעה דיסקי הזנת גליצרול לכל בקבוק בתנאים סטריליים. מ, להחזיר את flasks לאנקובטור רועד במשך 60 עד 90 שעות נוספות.
קח דגימות כל 24 שעות כדי לפקח על צפיפות התא ואת ביטוי החלבון על ידי ההתדאגה של בחירה. בסוף הטיפוח, להעביר את התרבויות לתוך צינורות חרוט 50 מ"ל עבור צנטריפוגה. יצא את נתוני המדידה המקוונים כקובץ גיליון אלקטרוני מהתוכנה לצורך ניתוח נוסף.
בטיפוח מייצג זה, ריכוז הגליצרול ההתחלתי היה 5%למרות דיסקי ההזנה נוספו כאשר הביומסה גדלה באופן אקספוננציאלי, החמצן ירד לכמעט אפס. ריכוזי גליצרול נמוכים יותר הפחיתו את ההשפעה של מגבלות החמצן לטווח קצר ולכן מומלצים לביטוי חלבון מודחק. בניסוי מייצג זה שבו הורמון גדילה אנושי בא לידי ביטוי תחת שליטתו של מקדם מודחק מקור פחמן על דלדול גליצרול ביטוי החלבון על ידי דה דיכוי הובטח על ידי תוספת של ארבעה דיסקי הזנה לכל בקבוקון.
כצפוי הביטוי הורמון גדילה האנושית ואת התפתחות הביומסה גדל לאורך זמן בנוכחות דיסקים הזנת גליצרול, בעוד ביטוי החלבון ירד לאורך זמן ביומסה נשאר קבוע בהיעדר תוסף גליצרול. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבחון בקפידה את פרמטרי הטיפוח כדי לקבוע את זמן ההתחלה של הביטוי האופטימלי. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו קביעת ריכוז חלבונים או בדיקות פעילות להערכת תפוקת חלבונים, כמו גם ניסויים ביו-רייקטורים בקנה מידה קטן כדי לענות על שאלות נוספות על הביצועים של הזן הבודד בקנה מידה גדול יותר.
לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ביטוי חלבון רקומביננטי ללא מתנול כדי לחקור חלופה מבטיחה מקדם AOX1 תלוי מתנול נפוץ על פישיה פסטוריס.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
