Biology
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खाद्य और पर्यावरणीय नमूनों से साल्मोनेला का अर्ध-metagenomic विश्लेषण
Chapters
Summary October 25th, 2018
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यहां, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए भोजन और पर्यावरण microbiomes से डीएनए नमूने तैयार करने के लिए और quasimetagenomic अनुक्रमण के माध्यम से साल्मोनेला के के उपलेखन का पता लगाने । संस्कृति संवर्धन के संयुक्त उपयोग, immunomagnetic जुदाई (आईएमएस), और कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) भोजन और पर्यावरण के नमूनों से साल्मोनेला जीनोमिक डीएनए की प्रभावी एकाग्रता की अनुमति देता है ।
Transcript
इस विधि का उपयोग खाद्य नमूनों से साल्मोनेला का पता लगाने और आनुवंशिक फिंगरप्रिंटिंग के माध्यम से रोगजनक को तनाव स्तर तक पहचानने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह साल्मोनेला का पता लगाने और एक ही कार्यप्रवाह में घटाव को जोड़ती है और काफी हद तक साल्मोनेला-दूषित खाद्य नमूने से रोगजनक के फिंगरप्रिंट के लिए बदलाव के समय को छोटा करती है । शुरू करने के लिए, एक बाँझ प्रयोगशाला ब्लेंडर बैग के अंदर भोजन का 25 ग्राम नमूना एक अंतर्निहित फिल्टर के साथ रखें या वैकल्पिक रूप से एक पर्यावरण झाड़ू तैयार करें, जो संवर्धन शोरबा के साथ स्पंज को गीला कर रहा है, इसे पूर्व निर्धारित सतह पर खींचकर एक ब्लेंडर बैग के अंदर रख रहा है।
एक प्रयोगशाला ब्लेंडर का उपयोग करना, आरवी संवर्धन शोरबा के 225 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक नमूने को अच्छी तरह से मिलाएं। फिर चार से 21 घंटे के लिए मिश्रण को 42 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। इसके बाद, बैग के फ़िल्टर किए गए पक्ष से संवर्धन शोरबा का 50 मिलीलीटर सबसंपल एकत्र करें।
फिर 10 मिनट के लिए 100 बार जी पर उपसंपाल को अपकेंद्री करें। ध्यान से 10 मिनट के लिए 3, 000 से 6, 000 बार जी पर एक नए 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए सुपरनेट को स्थानांतरित करें। सुपरनेट को त्यागें और बीपीडब्ल्यू के पांच मिलीलीटर में गोली धोएं।
बीपीडब्ल्यू के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। सबसे पहले, नमूना बफर और बर्फ पर एमडीए किट से प्रतिक्रिया बफर गल । बीपीडब्ल्यू में पुनर्संपित कोशिकाओं का एक मिलीलीटर और एंटी-साल्मोनेला मोतियों के 20 माइक्रोलीटर को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में रखें।
कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक घूर्णन मिक्सर पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें। इसके बाद ट्यूब को तीन मिनट के लिए मैग्नेटिक स्टैंड पर रखें। मोतियों को पैलेट में केंद्रित करने के लिए कई बार चुंबकीय रैक को उलटें।
चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखते हुए, एस्पिरेट और सुपरनेट त्यागें। इसके बाद, ट्यूब में वॉश बफर का एक मिलीलीटर जोड़ें। रैक से ट्यूब धारक को निकालें और परिसर से किसी भी गैर-विशेष रूप से बाध्यकारी बैक्टीरिया को हटाने के लिए ट्यूब धारक को कई बार उलटा करें।
तीसरे धोने के बाद, ट्यूब से सुपरनेट को एस्पिरेट करें और इसे त्याग दें। फिर चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें और इसे एक सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र करें। फिर किसी भी अवशिष्ट वॉश बफर को हटाने से पहले ट्यूब को तीन मिनट के लिए मैग्नेटिक रैक पर रखें।
नमूना बफर के नौ माइक्रोलीटर में बीड साल्मोनेला परिसरों को फिर से खर्च करें और ट्यूब को तीन मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। बर्फ पर परिसरों को ठंडा करने के बाद, प्रतिक्रिया बफर के नौ माइक्रोलीटर और एंजाइम मिश्रण का एक माइक्रोलीटर जोड़ें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार एक थर्मल साइकिलर में ट्यूब को इनक्यूबेट करें और बर्फ पर ट्यूब को ठंडा करें।
इसके बाद, नमूने की डीएनए एकाग्रता और शुद्धता को मापने के लिए फ्लोरोस्पेक्ट्रोमीटर उपकरण का उपयोग करें। भविष्य के प्रयोगों के लिए नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम उत्पादों को स्टोर करें। टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार प्रति सैंपल पीसीआर मिश्रण के 18 माइक्रोलीटर तैयार करें।
फिर एमडीए उत्पाद को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। पीसीआर मिश्रण में एमडीए उत्पाद निलंबन के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। एक अनुकूलित वास्तविक समय पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करके, टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार वास्तविक समय पीसीआर चलाएं।
पाठ प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट एमडीए उत्पाद में बफर समाधान और रिएजेंट जोड़ें और परिणामस्वरूप अनुक्रमण के 40 माइक्रोलीटर को एक नई प्लेट में स्थानांतरित करें और प्रत्येक कुएं में पीसीआर शुद्धि मोतियों के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें। इसके बाद, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट । फिर मोतियों को 80% इथेनॉल से धोएं और उन्हें 12 मिनट तक सुखा लें।
सूखे मोतियों को पुनः 53 माइक्रोलीटर में पुनर्पिण बफर को फिर से खर्च करें और कमरे के तापमान पर दो मिनट के लिए मोतियों को इनक्यूबेट करें। अंत में, निर्माता के निर्देशों के अनुसार पतला और पूल पुस्तकालय। इस प्रोटोकॉल में, साल्मोनेला डीएनए का लक्षित मात्रा मूल्यांकन वास्तविक समय पीसीआर द्वारा किया गया था।
साल्मोनेला-दूषित चिकन स्तन के दो ब्रांडों से प्रतिनिधि परिणाम ७०१.५४ से लेकर ९४५.८६ नैनोग्राम प्रति माइक्रोलिटर यह दर्शाता है कि नमूना डीएनए प्रभावी ढंग से परिलक्षित किया गया था । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, आईएमएस मोतियों को ध्यान से धोना और संभालना याद रखना महत्वपूर्ण है, एमडीए अभिकर्मकों और उत्पादों को संदूषकों से मुक्त रखें और एक साफ हुड बनाए रखें। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने खाद्य सुरक्षा और सार्वजनिक स्वास्थ्य के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए खाद्य नमूनों, उत्पाद वातावरण और आपूर्ति श्रृंखला में साल्मोनेला संदूषकों की तेजी से और उच्च संकल्प ट्रैकिंग का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया ।
यह न भूलें कि खाद्य जनित रोगजनकों के साथ काम करना बेहद खतरनाक हो सकता है और इस प्रक्रिया को निष्पादित करते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने और अच्छी प्रयोगशाला प्रथाओं का पालन करने जैसी सावधानियां बरतनी चाहिए।
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