Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen
Chapters
Summary June 19th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.
Transcript
Deze procedure kan ons helpen bij het identificeren van de functie van specifieke neuro-circuit die betrokken zijn bij de slaap wakkerheid verordening met minder invasieve manipulatie en hoge temporele resolutie. Deze methode stelt ons in staat de monitoring oppervlak EEG in real time in combinatie met manipulatie van een specifieke neuro-circuit om de causale relatie tussen circuits en slaap wakkerheid staten te onderzoeken. Shota Kodani gaat de procedure demonstreren.
Na bevestiging van een gebrek aan respons op teensnuifje, breng zalf aan op de ogen van het dier en gebruik de oorspen en neuspen op het stereotactische apparaat om het hoofd van de verdoofde muis op een absorberend pad te stabiliseren. Wanneer het hoofd is vastgesteld in positie, maak een mid-sagittale incisie in de hoofdhuid om te bevestigen dat de kruising tussen de sutura sagittalis en sutura coronalis of sutura lambdoidea zijn in een horizontale lijn op hetzelfde niveau. Om een positioneringsgat te voorkomen, stelt u de neussneus en de oorbalken zo nodig aan.
Dan met behulp van serafin klemmen aan het houden van de huid open desinfecteren het blootgestelde oppervlak van de schedel om de craniale hechtingen te visualiseersen duidelijker. Om de adeno-geassocieerde virusvector te injecteren, laadt u een ethanol gesteriliseerd 10 milliliter spuit met twee microliter minerale olie, gevolgd door het experimentele volume van het virus te injecteren. Gebruik de microinjectiepomp om de punt van de microinjectienaald op de bregma aan te passen en noteer de coördinaten als punt van oorsprong.
Verplaats vervolgens de punt naar de aangewezen injectieplaats en plaats de punt van de naald op de positie. Markeer de schedel op de injectieplaats en gebruik een tandboor uitgerust met een 0,7 millimeter carbidsnijder om een gat met een diameter van ongeveer twee millimeter in de schedel te boren. Na het verwijderen van bloed uit de buurt van het gat met een wattenstaafje, langzaam verplaatsen van de naald naar het bed kern van de stria terminalis of BSNT en langzaam injecteren van de aangewezen volume van het virus oplossing.
Laat de naald vervolgens vijf minuten op zijn plaats staan om de oplossing voldoende te laten infiltreren in het BNST-weefsel voordat u de naald zorgvuldig intrekt. Voor elektro-encefalogram, of EEG, en elektromyogram, of EMG, elektrode implantatie, eerst soldeer twee roestvrijstalen draden waaruit een millimeter isolatie is ontdaan van beide uiteinden aan de EMG-elektroden en plaats het centrum van de elektroden op de bregma. Markeer vervolgens de positie voor elke EEG-elektrode.
Om de positie van het optische vezelimplantaat te bepalen, bevestigt u een optische vezel ferrule aan de manipulator en draait u de manipulatorarm naar een plus- of min 30 graden hoek tegen een horizontale lijn. Zet de vezeltip op de bregma en leg de coördinaten vast. Verplaats de tip naar de beoogde invoeglijn en markeer de positie op de schedel en de positie voor de ankerschroef naast de invoegplaats.
Gebruik de tandheelkundige boor om de schedel te boren op elke site en gebruik de manipulator om voorzichtig invoegen van de optische vezel totdat het boven de BNST. De ferrule moet rusten op de resterende schedel. Zet de vezel vast aan de schedel met een ankerschroef, waarbij u ervoor zorgt dat de dura niet wordt gebroken of weefsel wordt beschadigd.
Bedek vervolgens de vezel en schroef met foto-geneesbaar tandcement. Boor vervolgens gaten voor EEG/EMG-elektroden en steek de punt van de eerste elektrode in één gat. Houd het implantaat met één hand vast, breng cyanoacrylaatlijm aan op de ruimte tussen de schedel en de elektrode en steek de elektrode de rest van de weg in, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen weefsel wordt beschadigd.
Wanneer alle elektroden zijn geplaatst, bedek dan de omtrek van de elektroden en de optische vezels met extra cyanoacrylaatlijm en cyanoacrylaatversneller om te voorkomen dat er onderbrekingen in de ferrule tot optische kabel en elektrode naar looddraad verbindingszones. Stel nu de nekspieren bloot en steek de draden voor de EMG-elektrode onder de spier. Pas de lengte van de EMG-elektrode zo aan dat deze net onder de nuchal-spieren past en vul de implantaten met meer cyanoacrylaatlijm en brandversneller.
Plaats vervolgens de muis op een warmtekussen met controle tot volledige recompensy. Voor EEG/EMG monitoring tijdens de foto-excitatie van gerichte neuronen, eerst gebruik maken van een scalar om de laser intensiteit aan te passen en gebruik een ferrule om de punt van de laserkabel tether aan een ongebruikte optische vezel. Bevestig dat er geen ruimte is op de kruising tussen de vezel en de kabel.
Na 20 minuten, stoot de opgewarmde laser aan de intensiteitscontrole uit en pas de intensiteit aan 10 milliwatt per millimeter kwadraat. Stel de lichtpulsduur in op 10 milliseconden, de rusttijd op 40 milliseconden, de cyclus op 20 en de herhaling op 20. Verander de lasermodus in transistorlogica en bevestig dat lichtpulsen worden uitgezonden door de vezel die wordt aangestuurd door de patroonregelaar.
Sluit de geïmplanteerde elektrode en kabeladapter aan en bedek de verbinding met licht ondoordringbaar materiaal om laserlekkage te voorkomen. En wanneer de laser klaar is, verplaats de muizen naar de experimentele kamer voor EEG / EMG opname. Om de latentie te beoordelen op wakkerheid van niet-snelle oogbeweging of snelle oogbeweging slaap, beperk de opnametijd en geoptimaliseerde site tijd winnen en laat de muizen vrij bewegen in de experimentele kamer voor ten minste een uur.
Tijdens de experimentele periode, monitor de EEG en EMG signalen in hetzelfde opnamescherm. Evalueer de toestand van de muis als wakkerheid, niet-snelle slaap van oogbewegingen of snelle slaap van oogbewegingen met behulp van de gain control voor elke golf voor het gemak van het onderscheiden van elke toestand. Voor het meten van de niet-snelle slaap van de oogbeweging naar wakkerheid latentie, observeren stabiele niet-snelle oogbeweging slaap gedurende 40 seconden, zet dan de patroon generator voor foto stimulatie en bevestigen laser emissie aan de geïmplanteerde optische vezels.
Neem vervolgens de EEG/EMG-signalen op totdat de slaaptoestand verandert in wakkerheid. Hier vertegenwoordigde EEG/EMG worden de sporen vóór en na fotostimulatie tijdens niet snelle slaap van de oogbeweging getoond. Een hoge spanning en langzame frequentie EEG zonder EMG signalen, vertegenwoordigt niet snelle oogbeweging slaap.
Foto stimulatie leidde tot een acute overgang naar wakkerheid ongeveer twee seconden na stimulatie in channelrhodopsine-2 uitdrukken muizen, terwijl de controle muizen niet aantonen deze overgang, wat suggereert dat de opwinding van BNST GABA neuronen tijdens niet-snelle oogbeweging slaap triggers een snelle inductie van wakkerheid. Omgekeerd, foto stimulatie tijdens snelle oogbeweging slaap had geen effect, zodat een overgangseffect alleen ontstaan in niet-snelle oogbeweging slaap. Het is belangrijk om te zorgen voor nauwkeurige coördinaties voor de virusinjectie en optische vezel implantatie stappen.
De EEG/EMG sporen die tijdens de slaapanalyse zijn vastgelegd, kunnen worden gebruikt om de gevolgen van de fotomanipulatie op de verschillende waakzame toestanden bij muizen te beoordelen. Deze techniek zal ons ook helpen bij het identificeren van andere componenten en circuits die betrokken zijn bij het reguleren van de slaap wakkerheid staten. Gebruik een veiligheidsbril om laserschade aan het oog te voorkomen en zorg ervoor dat u de adeno-geassocieerde virusvector container na gebruik altijd autoclave steriliseert.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
