Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
4D microscopie van gist
Chapters
Summary April 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit protocol beschrijft de analyse van fluorescently gelabelde intracellulaire compartimenten in ontluikende gist met behulp van Multi-Color 4D (time-lapse 3D) confocale microscopie. De beeldvormings parameters worden gekozen om adequate signalen vast te leggen en foto schade te beperken. Met aangepaste ImageJ-plug-ins kunnen gelabelde structuren worden bijgehouden en kwantitatief worden geanalyseerd.
Transcript
Deze methode volgt structuren in gistcellen in drie dimensies gedurende vele minuten, waardoor we de dynamiek van intracellulaire organellen en compartimenten kunnen bestuderen. 4D-beeldvorming zorgt ervoor dat we betrouwbare conclusies kunnen trekken over intracellulaire dynamiek, met name voor structuren of markers die van voorbijgaande aard kunnen zijn. Het aantonen van de procedure zal Natalie Johnson zijn, een postdoc uit mijn laboratorium.
Begin met het kweken van een nachtelijke cultuur van de gist stam van belang in vijf milliliter van niet-fluorescerende synthetische gedefinieerd, of NSD, medium, in een 15 milliliter verbijsterd kolf met een goede beerting, op 23 graden Celsius. Drie tot vier uur voor de analyse verdun de logaritmische fase gistcultuur in verse NSD-medium, zodat de uiteindelijke optische dichtheid op 600 nanometer, of OD600, 0,5 tot 0,8 zal zijn op het moment van beeldvorming. Ten minste een uur voordat de cultuur klaar is, centrifuge een aliquot van een twee milligram per milliliter Concanavalin Een oplossing gedurende vijf minuten op volle snelheid, om eventuele deeltjes pellet, en voeg 250 microliter van de supernatant in een schone 35 millimeter glazen bodem microscopie schotel.
Na 15 minuten, was de schotel twee tot drie keer met twee milliliter gedestilleerd water per wasbeurt, het toevoegen van 250 microliters van de gistcultuur aan de Concanavalin A-gecoate schotel nadat het is gedroogd. Wacht 10 minuten om de cellen te hechten, voordat zachtjes wassen van de schotel twee tot drie keer met twee milliliter verse NSD medium. Bedek vervolgens de cellen met twee milliliter verse NSD.
Om de gistcellen in beeld te brengen, selecteert u een 63X-olieonderdompelingslens met een numeriek diafragma van ten minste 1,4 op een confocale lichtmicroscoop. Hier kan een 100X objectieve lens ook worden gebruikt in plaats van een 63X objectieve lens. Plaats vervolgens de schotel op de objectieflens, gespot met onderdompelingsolie.
Selecteer xyzt in het vervolgkeuzemenu van het tabblad Acquisitiemodus. Op het tabblad XY wordt de framegrootte opgemaakt op 256 breedte bij 128 hoogte. Gebruik de maximale scansnelheid, die meestal op de orde van acht kilohertz.
Schakel bidirectioneel X-scannen in als deze beschikbaar is en pas de zoomfactor aan op negen, wat resulteert in een pixelgrootte van ongeveer 80 nanometer. Als een doelstelling van 100X wordt gebruikt, past u de zoomfactor dienovereenkomstig aan om een pixelgrootte van ongeveer 80 nanometer te behouden. Stel vervolgens de lijnaccumulatie in op vier of zes.
Stel het gaatje in op 1,2 luchtige eenheden en zet indien beschikbaar de witte lichtlaser aan. Stel vervolgens de excitatiegolflengte en procent laserkracht voor elk fluorescentiekanaal in. Schakel indien beschikbaar de gebruiksmodus van foton in onder het configuratietabblad door de maximale integratietijd uit te schakelen.
Wijs voor elk fluorescentiekanaal een detector met een hoge gevoeligheid toe, stel het emissiegolflengtebereik in en schakel indien beschikbaar de fotontelmodus in. Stel de tijd gating venster op 0,6 tot 10 nanoseconden voor elk fluorescentiekanaal, om te voorkomen dat het vastleggen van gereflecteerd licht van de glazen schotel. Schakel vervolgens heldere veldbeeldweergave in en selecteer een detector met een lage gevoeligheid voor het verzamelen van gegevens.
Schakel de live-beeldmodus in en zet de versterking in het heldere veldkanaal omhoog totdat de cellen duidelijk zichtbaar zijn. Als u in de fotontelmodus het bereik van de grijze waarden wijzigt van handmatig naar automatisch om het tl-signaal weer te geven. Stel de Z-stack in op het hele volume van gistcellen en geef de richting van de beeldvorming zodanig op dat naar beneden naar de afdekslip gaat.
Stel het Z-stapinterval in op 0,25 tot 0,35 micrometer om ongeveer 20 tot 25 optische secties per Z-stack te verkrijgen en schakel de Galvo-stroom in als deze beschikbaar is. Stel voor een typische film het tijdsinterval tussen Z-stacks in op twee seconden en stel de duur van de film in op vijf tot tien minuten. Sla vervolgens de film op als een LIF-bestand.
Voor filmdeconvolutie start u een geschikt deconvolutiesoftwareprogramma dat gebruik maakt van het klassieke schattingsalgoritme voor maximale kans en opent u de gegevensreeks. Selecteer deconvolution en parametereditor om te bevestigen dat de beeldvormingsparameters worden gedetecteerd en correct worden weergegeven. Wijzig de waarde van de inbeddingsmiddel refractieve index in 1,4 om het gistcytoplasma bij benadering te benaderen.
Gebruik vervolgens de editor om de dekkingsslippositie te schatten. Selecteer Alle geverifieerde opties instellen en klik op Accepteren en selecteer Wizard Enter. Klik op de volgende pijl om de selectie van de puntspreadfunctie en het bijsnijden van pre-processing fasen te omzeilen en ga door de wizard deconvolutie voor elk fluorescentiekanaal.
Selecteer de compute logaritmische verticale toewijzingsfunctie en inspecteer het profiel van de ruwe gegevensfluorescentieintensiteit. Stel handmatig in als de modus voor de achtergrondschatting, voer een achtergrondwaarde in en klik op Accepteren. Laat de maximale iteratiewaarde op 40 en voer een geschatte signaal-ruisverhouding in.
Schakel vervolgens de bleekmiddelcorrectie uit en klik op Deconvolve. Selecteer Accepteren naar het volgende kanaal in het venster deconvolutieresultaat, als het geluid voldoende wordt verwijderd zonder de echte fluorescentie van de schemerige structuren te elimineren. Zodra alle fluorescerende kanalen naar tevredenheid zijn gedeconvolviseerd, klikt u op Alles gedaan en rangschikt u eerst het rode kanaal, gevolgd door de groene, blauwe en heldere veldkanalen, voor latere bewerking in ImageJ.
Sla vervolgens de beeldreeks op als een TIF-bestand van acht bits en selecteer één bestand per kanaal en contrastrek als conversiemodus. Voor bleekmiddelcorrectie importeert u de gedeconvolveerde beeldsequenties in ImageJ en klikt u op Afbeelding, Hyperstack en Stapel naar Hyperstack om de afbeeldingen om te zetten in een hyperstack. Selecteer xyzct in het vervolgkeuzemenu en voer het aantal kanalen, Z-stack segmenten en tijdframes in.
Als u de fluorescentiekanalen voor het bleken van foto's wilt corrigeren, selecteert u Afbeelding, Kleur, Gesplitste kanalen en voor fluorescerende kanalen, selecteert u Plug-ins, EMBLtools, Bleach Correction en Exponential Fit. Selecteer vervolgens Kanalen voor afbeeldingen, kleuren en samenvoegen om het heldere veld samen te voegen en de gecorrigeerde fluorescentiekanalen samen te voegen tot een hyperstack en sla de gedeconvolveerde en gebleekte hyperstack op voor volgende filmgeneratie en bewerking als een acht-bits TIF-bestand. Als u de gedeconvolveerde en geblen gecorrigeerde gegevensset wilt converteren naar een geschaalde montage, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Montage-serie maken en selecteert u de relevante acht-bits hyperstack.
Klik op Openen en OK om te accepteren dat alle segmenten worden gebruikt om de montage te maken en klik nogmaals op OK om de voorgestelde schaalfactorwaarde te accepteren. Sla de originele montage op als een acht-bits TIF-bestand en selecteer Plugins, IJ_Plugins, Montage-serie naar Hyperstack en OK, om een 4D-hyperstack te maken van de oorspronkelijke montage die alle tijdschema's bevat. Als u de oorspronkelijke gemiddelde geprojecteerde film wilt genereren, selecteert u eerst Plug-ins, IJ_Plugins, Project Hyperstack en OK om de standaardparameters van ZProjection te accepteren.
Sla de gemiddelde geprojecteerde film op als een TIF-bestand van acht bits en inspecteer de film om afzonderlijke structuren te identificeren die kunnen worden bijgehouden voor de duur van hun etiketteringsperiode. Het identificeren van een structuur die betrouwbaar kan worden bijgehouden voor de duur van de film en het isoleren van die structuur voor analyse, zijn de meest kritieke stappen van de procedure. Volg vervolgens instructies in de gebruikershandleiding van de plugin om structuren van belang te isoleren door de montage te bewerken.
Maak een 4D-hyperstack van de bewerkte montage voor de periode inclusief de structuren van belang, en sla de bewerkte hyperstack. Als u de fluorescentieintensiteit in de loop van de tijd wilt kwantificeren voor de geïsoleerde structuur in de bewerkte 4D-hyperstack, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Edited Movie analyseren, voert u het tijdsinterval tussen Z-stacks in en klikt u op OK. Als u een definitieve film van de geïsoleerde structuur wilt maken, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Project Hyperstack, geeft u de Z-stacksegmenten op die moeten worden opgenomen, selecteert u Gemiddelde intensiteit als projectietype en klikt u op OK. Als u een 4D-hyperstack wilt maken met de oorspronkelijke gegevens over de bewerkte gegevens, selecteert u plug-ins, IJ_Plugins, Twee hyperstacks samenvoegen en Plaats eerst boven de seconde. Als u een film uit de 4D-hyperstack wilt genereren met de oorspronkelijke gegevens over de bewerkte gegevens, selecteert u Plug-ins, IJ_Plugins en Project Hyperstack, geeft u de Z-stacksegmenten op die moeten worden opgenomen, selecteert u Gemiddelde intensiteit als projectietype en klikt u op OK. Hier kan het eerste frame van een Z-stack projectie van ruwe gegevens worden vergeleken met dezelfde gedeconvolveerde en bleekmiddel gecorrigeerde gegevens.
Deze frames uit dezelfde gedeconvolveerde en gebleekte film tonen twee reservoirs die werden geanalyseerd, die eerst label met de groene Vanadate weerstand glycosylation eiwit 4 of Vrg4 marker, en later met de rode Secretory 7 of Sec7 gen transport eiwit marker. Deze montage, gemaakt van een gedeconvolveerde en bleekmiddel gecorrigeerde hyperstack, toont alle optische secties op een enkel tijdstip voor en na het bewerken, om isolatie van het signaal van een van de gekozen stortbak mogelijk te maken. In deze figuur worden verschillende frames uit de uiteindelijke film van de geprojecteerde Z-stacks weergegeven met de originele projecties aan de bovenkant van de figuur en bewerkte projecties aan de onderkant.
Kwantificering van de groene en rode fluorescerende signalen van de gekozen Golgi-reservoir laat zien dat de groene Vrg4-marker ongeveer 80 seconden aankomt en aanhoudt, waarna de rode Sec7-markering aankomt en ongeveer 60 seconden aanhoudt, met een korte overlap tussen de twee markeringen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om structuren te identificeren die ondubbelzinnig kunnen worden bijgehouden gedurende hun hele levensduur. Hetzelfde type analyse kan worden uitgevoerd na het maken van een mutatie of een ander type specifieke verstoring.
Deze techniek heeft de weg geopend naar het bestuderen van het dynamische gedrag van Golgi cisternae en endoplasmische reticulum exit sites met behulp van gist als een model systeem.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
