Biology
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खमीर की 4D माइक्रोस्कोपी
Chapters
Summary April 28th, 2019
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इस प्रोटोकॉल बहु रंग 4 डी (समय चूक 3 डी) confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर नवोदित खमीर में फ्लोरोसेंट लेबल intracellular डिब्बों के विश्लेषण का वर्णन करता है। इमेजिंग पैरामीटर photodamage सीमित करते समय पर्याप्त संकेतों पर कब्जा करने के लिए चुना जाता है. कस्टम ImageJ plugins लेबल संरचनाओं पर नज़र रखी और मात्रात्मक विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.
Transcript
यह विधि कई मिनटों में तीन आयामों में खमीर कोशिकाओं में संरचनाओं को ट्रैक करती है, जिससे हमें इंट्रासेलर ऑर्गेनेल्स और डिब्बों की गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है। 4D इमेजिंग यह सुनिश्चित करता है कि हम इंट्रासेलुलर गतिशीलता के बारे में विश्वसनीय निष्कर्ष निकाल सकते हैं, विशेष रूप से उन संरचनाओं या मार्कर के लिए जो क्षणिक हो सकते हैं। प्रक्रिया का प्रदर्शन नेटली जॉनसन, मेरी प्रयोगशाला से एक postdoc होगा ।
गैर फ्लोरोसेंट सिंथेटिक परिभाषित, या एनएसडी, मध्यम के पांच मिलीलीटर में ब्याज की खमीर तनाव की एक रात संस्कृति बढ़ रही द्वारा शुरू, अच्छा वातारण के साथ एक 15 मिलीलीटर चकित फ्लास्क में, 23 डिग्री सेल्सियस पर । विश्लेषण से तीन से चार घंटे पहले, ताजा एनएसडी माध्यम में लॉगरिथम चरण खमीर संस्कृति को पतला करें, ताकि इमेजिंग के समय 600 नैनोमीटर या OD600 पर अंतिम ऑप्टिकल घनत्व 0.5 से 0.8 हो जाएगा। संस्कृति के तैयार होने से कम से कम एक घंटे पहले, पूरी गति से पांच मिनट के लिए एक दो मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर Concanavalin एक समाधान के एक aliquoe, किसी भी कण गोली करने के लिए, और एक साफ ३५ मिलीमीटर ग्लास नीचे माइक्रोस्कोपी पकवान में सुपरनेटेंट के २५० माइक्रोलीटर जोड़ें ।
15 मिनट के बाद डिश को दो से तीन बार डिस्टिल्ड वॉटर प्रति वॉश के साथ धोएं, खमीर कल्चर के २५० माइक्रोलीटर को सूखने के बाद कॉनकानवेलियन ए-कोटेड डिश में जोड़ दें । कोशिकाओं का पालन करने की अनुमति देने के लिए 10 मिनट प्रतीक्षा करें, धीरे से ताजा एनएसडी माध्यम के दो मिलीलीटर के साथ दो से तीन बार पकवान धोने से पहले । फिर कोशिकाओं को ताजा एनएसडी के दो मिलीलीटर के साथ कवर करें।
खमीर कोशिकाओं की छवि के लिए, एक कॉन्फोकल लाइट माइक्रोस्कोप पर कम से कम 1.4 के संख्यात्मक अपर्चर के साथ 63X तेल विसर्जन लेंस का चयन करें। यहां 63X ऑब्जेक्टिव लेंस के बजाय 100X ऑब्जेक्टिव लेंस का भी इस्तेमाल किया जा सकता है । फिर, डिश को ऑब्जेक्टिव लेंस पर रखें, विसर्जन तेल के साथ देखा जाए।
अधिग्रहण मोड टैब के ड्रॉपडाउन मेनू से, xyzt का चयन करें। XY टैब के तहत, फ्रेम आकार को 128 ऊंचाई तक 256 चौड़ाई तक प्रारूपित करें। अधिकतम स्कैन गति का उपयोग करें, जो आमतौर पर आठ किलोहर्ट्ज के आदेश पर होता है।
यदि यह उपलब्ध है तो द्विदिशात्मक एक्स स्कैनिंग चालू करें, और ज़ूम फैक्टर को नौ में समायोजित करें, जिसके परिणामस्वरूप लगभग 80 नैनोमीटर का पिक्सेल आकार होगा। यदि 100X उद्देश्य का उपयोग किया जाता है, तो लगभग 80 नैनोमीटर के पिक्सेल आकार को बनाए रखने के लिए तदनुसार ज़ूम फैक्टर को समायोजित करें। फिर लाइन संचय को चार या छह पर सेट करें।
पिनहोल को 1.2 हवादार इकाइयों में सेट करें, और उपलब्ध होने पर सफेद प्रकाश लेजर चालू करें। फिर प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और प्रतिशत लेजर शक्ति निर्धारित करें। यदि उपलब्ध है, तो अधिकतम एकीकरण समय का चयन करके विन्यास टैब के तहत फोटॉन काउंटिंग मोड का उपयोग सक्षम करें।
प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए, एक उच्च संवेदनशीलता डिटेक्टर आवंटित करें, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य सीमा निर्धारित करें, और उपलब्ध होने पर फोटॉन गिनती मोड चालू करें। ग्लास डिश से परावर्तित प्रकाश को कैप्चर करने से बचने के लिए, प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए 0.6 से 10 नैनोसेकंड के लिए समय गेटिंग विंडो सेट करें। इसके बाद, उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग चालू करें, और डेटा संग्रह के लिए कम संवेदनशीलता डिटेक्टर का चयन करें।
लाइव इमेजिंग मोड चालू करें, और उज्ज्वल क्षेत्र चैनल में लाभ को तब तक चालू करें जब तक कि कोशिकाएं स्पष्ट रूप से दिखाई न दें। यदि फोटॉन काउंटिंग मोड में हैं, तो फ्लोरोसेंट सिग्नल देखने के लिए मैनुअल से स्वचालित तक ग्रे मानों की सीमा बदलें। खमीर कोशिकाओं की पूरी मात्रा छवि के लिए जेड-स्टैक सेट करें और इमेजिंग की दिशात्मकता को निर्दिष्ट करें जैसे कि कवर स्लिप की ओर नीचे चलता है।
जेड-स्टेप इंटरवल को 0.25 से 0.35 माइक्रोमीटर तक सेट करें ताकि जेड-स्टैक प्रति 20 से 25 ऑप्टिकल सेक्शन प्राप्त हो सके और उपलब्ध होने पर गैल्वो फ्लो को चालू कर दें। एक विशिष्ट फिल्म के लिए, जेड-स्टैक के बीच समय अंतराल को दो सेकंड तक सेट करें, और फिल्म की अवधि को पांच से 10 मिनट तक सेट करें। फिर फिल्म को एलआईएफ फाइल के रूप में सेव करें।
मूवी डिकोवोोल्यूशन के लिए, एक उपयुक्त डिकोवोल्यूशन सॉफ्टवेयर प्रोग्राम लॉन्च करें जो क्लासिक अधिकतम संभावना अनुमान एल्गोरिदम का उपयोग करता है, और डेटा श्रृंखला खोलता है। इमेजिंग पैरामीटर का पता लगाने और सही ढंग से प्रदर्शित करने की पुष्टि करने के लिए deconvolution जादूगर और पैरामीटर संपादक का चयन करें। एम्बेडिंग मीडियम अपवर्तक इंडेक्स के मूल्य को 1.4 तक बदलें ताकि खमीर साइटोप्लाज्म का अनुमान लगाया जा सके।
फिर कवर स्लिप स्थिति का अनुमान लगाने के लिए संपादक का उपयोग करें। सभी सत्यापित सेट चुनें और स्वीकार करें क्लिक करें, और एंटर जादूगर का चयन करें। बिंदु प्रसार समारोह चयन और पूर्व प्रसंस्करण चरणों फसल बाईपास करने के लिए अगले तीर पर क्लिक करें, और प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए deconvolution जादूगर के माध्यम से आगे बढ़ना ।
गणना लॉगरिथम वर्टिकल मैपिंग फ़ंक्शन का चयन करें और कच्चे डेटा फ्लोरेसेंस तीव्रता प्रोफ़ाइल का निरीक्षण करें। पृष्ठभूमि अनुमान के लिए मोड के रूप में मैनुअल सेट करें, पृष्ठभूमि मूल्य दर्ज करें, और स्वीकार करने पर क्लिक करें। अधिकतम पुनरावृत्तियों मूल्य को 40 पर छोड़ दें और शोर अनुपात के लिए अनुमानित संकेत दर्ज करें।
इसके बाद ब्लीच करेक्शन बंद कर दें और डेकॉन्वॉल पर क्लिक करें। डिम संरचनाओं से वास्तविक फ्लोरेसेंस को नष्ट किए बिना शोर को पर्याप्त रूप से हटा दिया जाता है, तो डिकोवोल्यूशन परिणाम विंडो में अगले चैनल पर स्वीकार करें। एक बार फ्लोरोसेंट चैनलों के सभी संतोषजनक रूप से deconvolved किया गया है, सब किया क्लिक करें और लाल चैनल की व्यवस्था पहले, हरे, नीले, और उज्ज्वल क्षेत्र चैनलों के बाद, ImageJ में बाद में संपादन के लिए ।
फिर छवि अनुक्रम को आठ बिट टीआईएफ फ़ाइल के रूप में सहेजें और प्रति चैनल एक फ़ाइल का चयन करें और रूपांतरण मोड के रूप में इसके विपरीत खिंचाव करें। ब्लीच सुधार के लिए, इमेजजे में डिकोवोल्ड इमेज सीक्वेंस आयात करें और इमेजेज में क्लिक करें इमेज, हाइपरस्टैक और स्टैक को हाइपरस्टैक में इंजेक्ट करें ताकि इमेज को हाइपरस्टैक में बदला जा सके। ड्रॉपडाउन मेनू से xyzct का चयन करें और चैनलों, जेड-स्टैक स्लाइस और समय सीमा की संख्या दर्ज करें।
फोटो ब्लीचिंग के लिए फ्लोरेसेंस चैनलों को सही करने के लिए, इमेज, कलर, स्प्लिट चैनल्स का चयन करें, और फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए, प्लगइन्स, एम्बलटूल, ब्लीच सुधार और एक्सपोनेन्शियल फिट का चयन करें। फिर उज्ज्वल क्षेत्र को मर्ज करने के लिए छवि, रंग और मर्ज चैनलों का चयन करें और फ्लोरेसेंस चैनलों को हाइपरस्टैक में ब्लीच करें, और बाद की फिल्म पीढ़ी और संपादन के लिए आठ बिट टीआईएफ फ़ाइल के रूप में डीकंवोल्ड और ब्लीच सही हाइपरस्टैक को बचाएं। एक स्केल्ड असेंबल में सेट किए गए डिकोवोल्ड और ब्लीच सही डेटा को बदलने के लिए, प्लगइन्स का चयन करें, IJ_Plugins करें, और असेंबल श्रृंखला बनाएं, और प्रासंगिक आठ बिट हाइपरस्टैक का चयन करें।
ओपन और ओके पर क्लिक करें स्वीकार करें कि सभी स्लाइस का उपयोग असेंबल बनाने के लिए किया जाएगा, और सुझाए गए स्केल फैक्टर मूल्य को स्वीकार करने के लिए फिर से ओके पर क्लिक करें। मूल असेंबल से 4डी हाइपरस्टैक बनाने के लिए आठ बिट टीआईएफ फ़ाइल के रूप में मूल असेंबल को सहेजें और प्लगइन्स, IJ_Plugins, असेंबल श्रृंखला को हाइपरस्टैक और ओके का चयन करें, जिसमें सभी समय-सीमा शामिल हैं। मूल औसत अनुमानित फिल्म उत्पन्न करने के लिए, पहले ZProjection डिफ़ॉल्ट मापदंडों को स्वीकार करने के लिए प्लगइन्स, IJ_Plugins, प्रोजेक्ट हाइपरस्टैक और ओके का चयन करें।
औसत अनुमानित फिल्म को आठ बिट टीआईएफ फ़ाइल के रूप में सहेजें और व्यक्तिगत संरचनाओं की पहचान करने के लिए फिल्म का निरीक्षण करें जिन्हें उनकी लेबलिंग अवधि की अवधि के लिए ट्रैक किया जा सकता है। एक संरचना है कि मज़बूती से फिल्म की अवधि के लिए ट्रैक किया जा सकता है की पहचान, और विश्लेषण के लिए है कि संरचना अलग, प्रक्रिया के सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं । फिर असेंबल संपादन द्वारा ब्याज की संरचनाओं को अलग करने के लिए प्लगइन उपयोगकर्ता गाइड में निर्देशों का पालन करें।
ब्याज की संरचनाओं सहित अवधि के लिए संपादित असेंबल से 4D हाइपरस्टैक बनाएं, और संपादित हाइपरस्टैक को बचाएं। संपादित 4D हाइपरस्टैक में अलग संरचना के लिए समय के साथ फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, प्लगइन्स का चयन करें, IJ_Plugins, और संपादित फिल्म का विश्लेषण करें, जेड-स्टैक के बीच समय अंतराल इनपुट करें, और ठीक क्लिक करें। अलग संरचना की एक अंतिम फिल्म बनाने के लिए, प्लगइन्स, IJ_Plugins और प्रोजेक्ट हाइपरस्टैक का चयन करें, जेड-स्टैक स्लाइस को निर्दिष्ट करें जिन्हें शामिल किया जाना चाहिए, अनुमान प्रकार के रूप में औसत तीव्रता का चयन करें, और ठीक क्लिक करें। संपादित डेटा पर मूल डेटा के साथ 4D हाइपरस्टैक बनाने के लिए, प्लगइन्स का चयन करें, IJ_Plugins, दो हाइपरस्टैक मर्ज करें, और दूसरे से ऊपर पहले स्थान दें। संपादित डेटा पर मूल डेटा के साथ 4D हाइपरस्टैक से एक फिल्म उत्पन्न करने के लिए, प्लगइन्स, IJ_Plugins और प्रोजेक्ट हाइपरस्टैक का चयन करें, जेड-स्टैक स्लाइस को निर्दिष्ट करें जिन्हें शामिल किया जाना चाहिए, अनुमान प्रकार के रूप में औसत तीव्रता का चयन करें, और ठीक क्लिक करें। यहां, कच्चे डेटा के जेड-स्टैक प्रक्षेपण के पहले फ्रेम की तुलना उसी डिकोवोल्ड और ब्लीच सही डेटा से की जा सकती है।
एक ही deconvolved और ब्लीच सही फिल्म से इन फ्रेम दो cisternae कि विश्लेषण किया गया है, जो पहले हरे Vanadate प्रतिरोध ग्लाइकोसिलेशन प्रोटीन 4 या Vrg4 मार्कर के साथ लेबल, और बाद में लाल Secretory 7 या Sec7 जीन परिवहन प्रोटीन मार्कर के साथ दिखाते हैं । यह असेंबल, एक deconvolved और ब्लीच सही हाइपरस्टैक से बनाया गया है, संपादन से पहले और बाद में एक ही समय बिंदु पर ऑप्टिकल वर्गों के सभी से पता चलता है, चुने हुए cisternae में से एक से संकेत के अलगाव की अनुमति है । इस आंकड़े में, अनुमानित जेड-स्टैक की अंतिम फिल्म से कई फ्रेम को आंकड़े के शीर्ष पर मूल अनुमानों के साथ दिखाया गया है और नीचे अनुमानों को संपादित किया गया है।
चुने गए गोलगी सिस्टरे से हरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेतों के क्वांटिफिकेशन से पता चलता है कि ग्रीन Vrg4 मार्कर आता है और लगभग 80 सेकंड तक बना रहता है, जिसके बाद, लाल Sec7 मार्कर आता है और दो मार्कर के बीच एक संक्षिप्त ओवरलैप के साथ लगभग 60 सेकंड तक बना रहता है। इस प्रक्रिया को करते समय, उन संरचनाओं की पहचान करना महत्वपूर्ण है जिन्हें उनके पूरे जीवन काल में स्पष्ट रूप से ट्रैक किया जा सकता है। एक ही प्रकार का विश्लेषण उत्परिवर्तन या किसी अन्य प्रकार के विशिष्ट क्षोभ बनाने के बाद किया जा सकता है।
इस तकनीक ने एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर का उपयोग करके गोलगी सिस्टर्न और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम निकास साइटों के गतिशील व्यवहार का अध्ययन करने का रास्ता खोल दिया है।
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