Journal
/
/
4D mikroskopi av jäst
JoVE Journal
Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Journal Biology
4D Microscopy of Yeast

4D mikroskopi av jäst

8,343 Views

12:00 min

April 28, 2019

DOI:

12:00 min
April 28, 2019

3 Views
,

Transcript

Automatically generated

Denna metod spårar strukturer i jästceller i tre dimensioner under många minuter, så att vi kan studera dynamiken i intracellulära organeller och fack. 4D-avbildning säkerställer att vi kan dra tillförlitliga slutsatser om intracellulär dynamik, särskilt för strukturer eller markörer som kan vara övergående. Demonstrera förfarandet kommer att Natalie Johnson, en postdoc från mitt laboratorium.

Börja med att odla en övernattning kultur av jästen stam av intresse i fem milliliter av icke-fluorescerande syntetiska definieras, eller NSD, medium, i en 15 milliliter förbryllad kolv med god avering, vid 23 grader Celsius. Tre till fyra timmar före analysen, späd den logaritmiska fasjästkulturen i färskt NSD-medium, så att den slutliga optiska densiteten vid 600 nanometer, eller OD600, blir 0,5 till 0,8 vid tidpunkten för bildbehandling. Minst en timme innan kulturen är klar, centrifug en alikvot av en två milligram per milliliter Concanavalin En lösning i fem minuter med full hastighet, att pelleta några partiklar, och tillsätt 250 mikroliter av supernatant i en ren 35 millimeter glas botten mikroskopi skålen.

Efter 15 minuter, tvätta skålen två till tre gånger med två milliliter destillerat vatten per tvätt, lägga till 250 mikroliter av jästkulturen till Concanavalin A-belagda skålen efter det torkas. Vänta i 10 minuter så att cellerna kan hålla sig, innan du försiktigt tvättar disken två till tre gånger med två milliliter färskt NSD-medium. Täck sedan cellerna med två milliliter färsk NSD.

För att avbilda jästcellerna väljer du ett 63X oljebadlins med en numerisk bländare på minst 1,4 på ett konfokalt ljusmikroskop. Här kan en 100X objektivet också användas i stället för en 63X objektiv lins. Sedan, placera skålen på objektivet linsen, fläckig med nedsänkning olja.

På dropdown-menyn på fliken Förvärvsläge väljer du xyzt. Under fliken XY formaterar du ramstorleken till 256 bredd med 128 höjd. Använd den maximala skanningshastigheten, som vanligtvis är i storleksordningen åtta kilohertz.

Aktivera dubbelriktad X-skanning om den är tillgänglig, och justera zoomfaktorn till nio, vilket kommer att resultera i en pixelstorlek på cirka 80 nanometer. Om ett 100X-mål används, justera zoomfaktorn i enlighet med detta för att bibehålla en pixelstorlek på cirka 80 nanometer. Ställ sedan in linjeansamlingen på fyra eller sex.

Ställ in tapphålet på 1,2 Luftiga enheter, och slå på den vita ljuslasern, om det finns tillgängligt. Ställ sedan in excitation våglängd och procent laserkraft för varje fluorescens kanal. Om det är tillgängligt aktiverar du användningen av läget för inventering av foton under fliken konfiguration genom att avmarkera maximal integrationstid.

För varje fluorescenskanal tilldelar du en högkänslighetsdetektor, ställer in utsläppsvåglängdsområdet och aktiverar läget för fotograferingsräkning, om det finns tillgängligt. Ställ in tiden gating fönstret till 0,6 till 10 nanosekond för varje fluorescens kanal, för att undvika att fånga reflekterat ljus från glasfatet. Därefter aktiverar du ljusstark fältavbildning, och väljer låg känslighetsdetektor för datainsamlingen.

Aktivera läget för live-avbildning, och vrid upp förstärkningen i den ljusa fältkanalen tills cellerna syns tydligt. Om i foton inventering läge, ändra intervallet för grå värden från manuell till automatisk för att visa lysrörssignalen. Ställ in Z-stacken på bild hela volymen av jästceller och ange riktningsbarheten för avbildningen så att nedåt rör sig mot omslagssnedsteget.

Ställ in Z-steg-intervallet på 0,25 till 0,35 mikrometer för att erhålla ca 20 till 25 optiska sektioner per Z-stack, och slå på Galvo Flow om det är tillgängligt. För en typisk film ställer du in tidsintervallet mellan Z-stackar till två sekunder, och ställer in filmens varaktighet på fem till tio minuter. Spara sedan filmen som en LIF-fil.

För film deconvolution, starta en lämplig deconvolution mjukvaruprogram som använder den klassiska maximal sannolikhet uppskattning algoritm, och öppna dataserien. Välj Avconvolution-guiden och parameterredigeraren för att bekräfta att avbildningsparametrarna identifieras och visas korrekt. Ändra inbäddningsmediet brytningsindexs värde till 1,4 för att approximera jästcytoplasman.

Använd sedan editorn för att uppskatta höljets slipposition. Välj Ange alla verifierade och klicka på Acceptera och välj Guiden Ange. Klicka på nästa pil för att kringgå valet av punktspridningsfunktion och beskära förbearbetningsstadium, och fortsätt genom deconvolution-guiden för varje fluorescenskanal.

Välj den compute logaritmiska vertikala mappningsfunktionen och inspektera profilen för rådatafluorescensintensitet. Ange manuell som läge för bakgrundsuppskattningen, ange ett bakgrundsvärde och klicka på Acceptera. Lämna värdet för maximala iterationer vid 40 och ange ett beräknat signal-brusförhållande.

Stäng sedan av blekmedelskorrigeringen och klicka på Deconvolve. Välj Acceptera till nästa kanal i deconvolution resultatfönstret, om bruset är tillräckligt bort utan att eliminera den äkta fluorescens från dim strukturer. När alla de fluorescerande kanalerna har deconvolved tillfredsställande, klicka på Allt gjort och ordna den röda kanalen först, följt av den gröna, blå och ljusa fältkanaler, för efterföljande redigering i ImageJ.

Spara sedan bildsekvensen som en åtta bitars TIF-fil och välj en fil per kanal och kontraststräckning som konverteringsläge. För blekmedel korrigering, importera de deconvolved bildsekvenser i ImageJ och klicka på Bild, Hyperstacks, och Stack till Hyperstack att omvandla bilderna till en hyperstack. Välj xyzct på dropdown-menyn och ange antalet kanaler, Z-stacksegment och tidsramar.

Om du vill korrigera lysrörskanalerna för fotoblekning väljer du Bild, Färg, Dela kanaler och för lysrörskanaler genom att välja Insticksmoduler, EMBL-verktyg, Blekmedelskorrigering och Exponentiell passform. Välj sedan Bild, Färg och Sammanfoga kanaler för att slå samman det ljusa fältet och bleka korrigerade fluorescenskanaler till en hyperstack, och spara deconvolved och blekmedel korrigerade hyperstack för efterföljande filmgenerering och redigering som en åtta bitars TIF-fil. Om du vill konvertera de deconvolved och blekmedel korrigerade datamängden till ett skalat montage väljer du Plugins, IJ_Plugins och Make Montage Series och väljer relevant åtta bitars hyperstack.

Klicka på Öppna och OK om du vill acceptera att alla segment kommer att användas för att skapa montaget och klicka på OK igen för att acceptera det föreslagna skalfaktorvärdet. Spara den ursprungliga montage som en åtta bitars TIF-fil och välj Plugins, IJ_Plugins, Montage Series till Hyperstack och OK, för att skapa en 4D hyperstack från den ursprungliga montage som omfattar alla de tidsramar. För att generera den ursprungliga genomsnittliga projicerade filmen, välj först Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack och OK, för att acceptera de ZProjection standardparametrar.

Spara den genomsnittliga projicerade filmen som en åtta bitars TIF-fil och inspektera filmen för att identifiera enskilda strukturer som kan spåras under hela deras märkningsperiod. Att identifiera en struktur som kan spåras på ett tillförlitligt sätt under hela filmen, och isolera den strukturen för analys, är de mest kritiska stegen i proceduren. Följ sedan instruktioner i plugin användarhandboken, för att isolera strukturer av intresse genom att redigera montage.

Skapa en 4D-hyperstack från det redigerade montaget för perioden inklusive strukturerna av intresse, och spara den redigerade hyperstacken. Om du vill kvantifiera fluorescensintensiteten över tiden för den isolerade strukturen i den redigerade 4D-hyperstack väljer du Plugins, IJ_Plugins och Analysera redigerad film, matar in tidsintervallet mellan Z-stackar och klickar på OK. Om du vill skapa en slutlig film av den isolerade strukturen väljer du Plugins, IJ_Plugins och Project Hyperstack, anger de Z-stacksegment som ska ingå, välj Medelintensitet som projektionstyp och klicka på OK. Om du vill skapa en 4D-hyperstack med de ursprungliga uppgifterna över de redigerade data väljer du plugins, IJ_Plugins, Merge Two Hyperstacks och Place first above second. Om du vill generera en film från hyperstacken i 4D med originaldata över de redigerade data väljer du Plugins, IJ_Plugins och Project Hyperstack genom att ange de Z-stacksegment som ska ingå, välj Genomsnittlig intensitet som projektionstyp och klicka på OK. Här kan den första ramen i en Z-stack projektion av rådata jämföras med samma deconvolved och blekmedel korrigerade data.

Dessa ramar från samma deconvolved och blekmedel korrigeras filmen visar två cisternae som analyserades, som först etikett med den gröna Vanadat motstånd glykosylering protein 4 eller Vrg4 markör, och senare med den röda Secretory 7 eller Sec7 gen transport protein markör. Detta montage, som skapats från en deconvolved och blekmedel korrigeras hyperstack, visar alla av de optiska sektioner vid en enda tidpunkt före och efter redigering, för att tillåta isolering av signalen från en av de valda cisternae. I denna figur visas flera bildrutor från den slutliga filmen av de projicerade Z-stackarna med de ursprungliga projektionerna högst upp i figuren och redigerade projektioner längst ned.

Kvantifiering av de gröna och röda fluorescerande signaler från den valda Golgi cisternae avslöjar att den gröna Vrg4 markören anländer och kvarstår i ca 80 sekunder, varefter, den röda Sec7 markören anländer och kvarstår i ca 60 sekunder, med en kort överlappning mellan de två markörerna. När du utför den här proceduren är det viktigt att identifiera strukturer som kan entydigt spåras under hela deras livstid. Samma typ av analys kan utföras efter att ha gjort en mutation eller någon annan typ av specifik perturbation.

Denna teknik har öppnat vägen för att studera det dynamiska beteendet hos Golgi cisternae och endoplasmatiska reticulum exit platser med hjälp av jäst som modell system.

Summary

Automatically generated

Detta protokoll beskriver analysen av fluorescerande märkta intracellulära fack i spirande jäst med flera färger 4D (Time-lapse 3D) konfokal mikroskopi. Avbildnings parametrarna väljs för att fånga upp lämpliga signaler samtidigt som foto skador begränsas. Custom ImageJ plugins tillåta märkta strukturer spåras och kvantitativt analyseras.

Read Article