细胞外环境富含调控细胞行为的生化和物理信号。特别是，微环境的物理特性可介导细胞生长、迁移和分化等关键细胞功能¹^,²^,³^,⁴。微环境力学特性的失调是多种尚无有效治疗方法的疾病的重要组成部分，例如癌症⁵、动脉粥样硬化⁶和纤维化⁷。要全面理解细胞如何将物理刺激转化为生化可检测信号（该过程称为机械转导），需要阐明介导力传递的分子机制，包括细胞内外以及多种亚细胞结构内部的力传递过程。

在亚细胞结构内部，蛋白质持续发生着动态更替，其与结合伙伴之间的结合与解离取决于相互作用的强度⁸。为了使力能够成功跨越物理距离传递，必须存在一条连续不断的蛋白质-蛋白质相互作用链，这意味着蛋白质的周转速率必须足够缓慢，以维持并将其所受的力传递给其结合伙伴⁹。尽管蛋白质-蛋白质相互作用通常由蛋白质结构域之间的多个非共价键组成，但这种相互作用常被概念化为一种可在不同条件下从结合态转变为非结合态的状态¹⁰^,¹¹。对于特定的蛋白质-蛋白质相互作用而言，外力可能对其相互作用寿命无影响，称为"理想键"；也可能缩短其寿命，称为"滑脱键"；或延长其寿命，称为"捕获键"¹⁰。因此，蛋白质所受载荷与其动力学行为之间存在着复杂的关联，我们将这种关系称为力敏感性动力学。

为了理解载荷对键合动力学的影响，研究人员已在单分子水平上开展了一系列信息丰富的实验。通过使用分离的蛋白质或蛋白质片段，结合磁镊、光镊和原子力显微镜等操纵技术，这些研究已证明多种相关蛋白质存在力敏感的蛋白质-蛋白质相互作用¹¹^,¹²。整合素¹³和钙黏蛋白¹⁴均为跨膜蛋白，分别在细胞-基质和细胞-细胞相互作用的形成中起重要作用，其动力学行为均已被证实会因受力而发生改变。在细胞内，黏着斑蛋白（vinculin）以依赖于力学的方式被招募至踝蛋白（talin）¹⁵和α-连环蛋白（α-catenin）¹⁶，并可与肌动蛋白形成捕获键（catch bond）¹⁷，表明在载荷条件下，黏着斑蛋白在黏着斑（FAs）和黏附连接（AJs）中均发挥关键作用。单分子研究能够分离特定的蛋白质-蛋白质相互作用，获得明确的结果，但无法反映细胞环境的复杂性。

标志性实验表明，多种亚细胞结构（包括黏着斑（FAs）和黏附连接（AJs））具有力学敏感性，并会在细胞自身产生或外界施加的力学负荷下表现出增强的组装效应¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²。此外，多个理论模型提示，这种力学敏感性组装可能由力敏感的蛋白质动态过程所驱动²³^,²⁴^,²⁵。为了在活细胞内研究这些力敏感的动态过程，已有若干间接方法被采用。荧光漂白恢复技术（FRAP）及其相关技术为测量细胞内蛋白质动态提供了相对简便的方法²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹。然而，对蛋白质所受负荷的测量则较为有限。一种典型方法是将暴露于细胞骨架抑制剂（用于降低细胞整体收缩力）的细胞与未暴露的细胞进行蛋白质动态比较⁸^,³⁰^,³¹。从概念上讲，这相当于在高负荷与低负荷状态之间进行比较。但该方法并未对两种状态下蛋白质所承受的负荷进行量化，且抑制剂可能带来非预期的生化效应，例如导致F-肌动蛋白丝上关键结合位点的丢失。另一种针对黏着斑（FAs）的方法是利用牵引力显微镜测量黏着斑对基底施加的总作用力，以估算分子水平的负荷，并分析其与黏着斑内单一蛋白质动态之间的关系³²。尽管该方法可实现对总作用力的量化，却无法提供分子特异性的信息。黏着斑由超过200种不同蛋白质组成，其中许多蛋白均可承受力学负荷³³。因此，仅测量黏着斑的总力输出可能掩盖了多种力传递通路并存的可能性，也无法可靠地反映特定蛋白质所受的负荷。

与以往的力学生物学方法不同，基于FRET的张力传感器的出现使得能够直接测量活细胞内特定蛋白质所承受的力学载荷³⁴^,³⁵^,³⁶。本文介绍了一种将基于FRET的张力传感器与基于FRAP的蛋白质动力学测量方法相结合的实验方案，我们将该技术称为FRET-FRAP。该方法可同时测量蛋白质所受力学载荷及其动力学行为，从而实现对活细胞中力敏感性蛋白质动力学的评估（图1）。目前，FRET-FRAP技术已成功应用于机械连接蛋白vinculin的力敏感性动力学研究³⁷。研究人员已开发出多种针对不同亚细胞结构中关键蛋白质的张力传感器。例如，针对黏着斑（FAs）中的vinculin³⁴和talin³⁸^,³⁹，黏附连接（AJs）中的cadherin和catenin⁴⁰^,⁴¹^,⁴²，细胞核LINC复合物中的nesprin⁴³，细胞骨架中的α-actinin⁴⁴和filamin³⁶，以及糖萼中的MUC-1⁴⁵等均已有相应的传感器被开发⁴⁶。同样，FRAP技术也已被广泛用于研究局灶性黏附⁸^,³¹、黏附连接⁴⁷、肌动蛋白皮层²⁶以及细胞核⁴⁸中力敏感蛋白的动力学行为。未来，FRET-FRAP技术可广泛适用于上述已有的或新开发的各类张力传感器，从而在多种亚细胞结构和生理背景下实现对力敏感性动力学的测量。为此，我们提供了一个详细且通用的FRET-FRAP技术实施方案，适用于不同生物系统。希望该方案能够推动开展多种实验，深入阐明各类力敏感蛋白在调控力传递及介导细胞行为中的作用。

该方法可以解答力学生物学领域的一些关键问题，例如力如何在细胞内以及细胞与其环境之间传递和感知。该技术的主要优势在于，它能够获取有关蛋白质在活细胞天然环境中响应机械力的分子尺度信息。尽管该方法已专门用于研究局灶性黏附蛋白vinculin，但也可应用于其他对机械力敏感的蛋白质，例如talin、cadherins或nesprin。

该方法的可视化演示至关重要，因为正确的成像设置虽具挑战性，但对分析成功十分必要。首先，按照文本方案中的详细说明，在目标细胞类型中稳定表达张力传感器构建体。为准备用于接种细胞的基底，需准备四个35毫米玻璃底培养皿。

在细胞培养超净台中，于15毫升锥形管内配制4毫升浓度为10微克/毫升的纤连蛋白（fibronectin）无菌磷酸盐缓冲液（PBS）溶液。轻轻倒置混匀一次，于细胞培养超净台中静置5分钟。随后，将1毫升纤连蛋白溶液加入每个玻璃底培养皿中。

将纤连蛋白溶液在室温下孵育一小时，或在 4°C 过夜。然后吸除纤连蛋白溶液，并用 PBS 洗涤一次。在培养皿中保留 1 mL PBS，直至细胞准备接种。

计数细胞后，将30,000个细胞接种至每孔含纤维连接蛋白包被的玻璃培养皿中，加入适量的完全培养基，终体积为1.5毫升。接种后让细胞贴壁伸展4小时。在细胞贴壁2小时时，吸除生长培养基，并用成像培养基冲洗一次。

留下 1.5 毫升成像培养基。在开始校准之前，按照文本方案中的描述预热显微镜。为了校准 FRAP 激光，首先打开激光配置窗口。

将照明设置调整为适合样品激光曝光的相应FRAP照明设置。然后将照明设置调整为仅对受体荧光染料成像的合适照明条件。在坐标系设置下选择需要校准的物镜。

取消勾选“手动单击校准点”，勾选“校准期间显示图像”。将停留时间设置为 10,000 微秒，脉冲次数设置为 100。现在将校准载玻片（由溴化乙锭密封在载玻片与盖玻片之间制成）放入载物台适配器中，盖玻片一侧朝下。

使用受体照明设置聚焦于载玻片表面，该表面可识别为具有最亮信号的焦平面。涂层中的微小缺陷将可见，有助于聚焦。移动载玻片至成像平面内荧光均匀的区域。

首次校准时点击“创建设置”，后续校准则点击“更新设置”。软件将启动校准程序，自动进行漂白并检测漂白点的位置。通过评估最终图像来确保校准成功，最终图像应为一个3×3的漂白点阵列，各点应分布均匀且聚焦清晰。

将校准图像保存以供日后参考。取下校准载玻片并妥善保存。每次实验开始前应进行校准，但样品之间无需重复校准。

准备用于活细胞成像的显微镜系统，最好配备加热载物台和物镜，以及二氧化碳控制装置。平衡系统20分钟。随后将表达张力传感器的细胞样本之一放入显微镜样品 holder 中进行成像。

让细胞平衡10分钟。为确保成像细胞的健康状态，需在成像腔室内维持37摄氏度的温度。使用蠕动泵以每分钟15毫升的流速向样品通入加湿的5%二氧化碳，以维持pH值。

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利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学