הסביבה חוץ-תאי הוא מקור עשיר של סימנים ביוכימיים והן פיזית המכתיבים בהתנהגות התא. בפרט, הטבע הגופני של microenvironment יכולה לתווך תאיים מפתח, כולל צמיחת תאים, העברה של בידול1,2,3,4. Dysregulation של המכניקה של microenvironment הוא מרכיב קריטי למחלות רבות שאין להן עדיין טיפולים נאותים, כגון סרטן5, טרשת עורקים6ו פיברוזיס7. הבנה מלאה של מה תאים להמיר לגירויים פיזיים לאותות נסתרים מבחינה ביוכימית, תהליך הנקרא mechanotransduction, דורש הבהרה של המנגנון המולקולרי תיווכה כוח שידור, לתוך והן התאים ו בתוך מבנים subcellular מרובים.
בתוך מבנים subcellular, חלבונים משתנים כל הזמן איגוד, פעולת ההוצאה מהאוגדן המבוססת על האינטראקציות שלהם עם האיגוד שותפים8. עבור כוחות בהצלחה ישודרו על-פני מרחק פיזי, בטח יש שרשרת רצופה של אינטראקציות חלבון-חלבון, כלומר כי המחזור של חלבון חייבת להיות איטית מספיק לקיים ולשדר לכוח השותף שלה מחייב9. בעוד אינטראקציות חלבון-חלבון כלל מורכבות של מספר שאינו-קשרים הדדיים בין חלבון, האינטראקציה נתפסת לעתים קרובות כמדינה מאוגד יכול העוברות למצב לא מאוגד תחת תנאים שונים10, 11. לאינטראקציה חלבון נתון, זה אפשרי כי כוח יכולים להיות ללא השפעה על חייו של האינטראקציה, המכונה "בונד אידיאלי", להפחית את אורך החיים של האינטראקציה, המכונה "קשר slip," או להגדיל את אורך החיים של האינטראקציה , המכונה "לתפוס בונד"10. לפיכך, יש מערכת יחסים מורכבות בין עומס חלבון חלבון דינמיקה, אשר אנו מתייחסים כאל רגישים ל"כוח הפזורים דינמיקה.
לקראת הבנת ההשפעה של עומס על דינמיקה בונד, בוצעו מספר ניסויים מאוד אינפורמטיבי על רמת מולקולה בודדת. באמצעות חלבונים מבודד, או שברי חלבונים ו טכניקות מניפולציה כגון פינצטה מגנטי, מלקחיים אופטיים מיקרוסקופ כוח אטומי, מחקרים אלה הראו אינטראקציות חלבון רגישים ל"כוח הפזורים עבור מספר הרלוונטיים חלבונים11,12. שניהם אינטגרינים13 ו cadherins14, אשר חשוב עבור יוצרים אינטראקציות מטריצה תא ותא תא, בהתאמה transmembrane חלבונים, הראו שינויים ב- dynamics בשל כדי לטעון. בתוך התא, vinculin הוא גויס בשני talin15 וα-catenin16 באופן תלוי-כוח והוא יכול ליצור קשר לתפוס עם אקטין17, המציינת את תפקיד מכריע עבור vinculin-מוקד הדבקויות (FAs) והן adherens צמתים (AJs ) תחת עומס. מולקולה בודדת מחקרים לאפשר ניתוקה של אינטראקציות חלבון ספציפי להניב פירות ברורה וחד משמעית, אבל הם לא מהווים המורכבות של הסביבה התאית.
ציון דרך ניסויים הראו כי מספר מבנים subcellular, כולל FAs ו AJs, הן mechanosensitive, התערוכה הרכבה משופרת בתגובה נטען שנוצר באופן פנימי או חיצוני שהוחל18,19, 20,21,22. בנוסף, מספר מודלים תיאורטיים הראו כי מכלול mechanosensitive יכול להיות מונע על ידי כוח רגיש חלבון dynamics23,24,25. לבחון הדינמיקות האלה רגישים ל"כוח הפזורים בתוך תאים חיים, ננקטו כמה גישות עקיף. FRAP טכניקות הקשורות לספק מתודולוגיה פשוטה יחסית למדידת חלבון דינאמיקה של תאים26,27,28,29. עם זאת, המדד של עומס חלבון הוגבלה יותר. גישה אופיינית היא להשוות dynamics החלבון בתאים עם ובלי את החשיפה מעכב cytoskeletal להשתמש בהם כדי להפחית הכוללת תא contractility8,30,31. מבחינה מושגית, זוהי השוואה בין לעומס גבוה לבין המדינה עומס נמוך. עם זאת, יש אין כימות של העומס על פני החלבון במצב או, ייתכן שיש לא מכוונות אפקטים הביוכימי של המדכא, כגון אובדן של אתרי קישור מפתח לאורך נימה F-אקטין. גישה אחרת, ספיציפית FAs, כבר למדוד מאמץ כוח מוחלט על המצע על-ידי הפא באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה משוער עומס מולקולרית ולבחון את הקשר עם הדינמיקה של חלבון יחיד בתוך הפא32. בעת גישה זו מאפשרת כימות של הכוח הכולל, אינה מספקת מידע מולקולרי ספציפי. FAs מורכב של מעל 200 חלבונים שונים, רבים מהם יכול לשאת עומס33. לפיכך, מדידת הפלט כוח מוחלט של הפא פוטנציאל מטשטש את האפשרות של מסלולים שידור כוח מרובים, לא אמין לספק מידה של עומס על חלבון ספציפי.
בניגוד גישות הקודם ב- mechanobiology, כניסתו של מתח מבוסס סריג חיישנים מאפשר ישיר מדידה של המון מנוסים על ידי חלבונים ספציפיים בתוך החיים תאים34,35,36. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמשלב מתח מבוסס סריג חיישנים מבוססי FRAP מדד של חלבון דינמיקה. אנו מתייחסים טכניקה זו כאל FRAP סריג. גישה זו מאפשרת את המדידה בו זמנית של עומס חלבון ואת הדינמיקה חלבון, ובכך מאפשר את ההערכה של דינמיקת רגישים ל"כוח הפזורים חלבונים בתאים חיים (איור 1). . כבר, הטכניקה סריג-FRAP הוחל במחקר של הדינמיקות רגישים ל"כוח הפזורים של vinculin חלבון37מקשר מכני. המתח חיישנים פותחו חלבונים רבים הרלוונטיים במגוון מבנים subcellular. לדוגמה, חיישנים פותחו עבור vinculin34 / talin38,39 FAs, cadherins catenins AJs40,41,42, nesprin ב הלינק גרעיניים מורכבים 43, α-actinin44 , filamin36 , שלד התא, ו- MUC-1 ב- glycocalyx45, בין היתר46. בדומה, FRAP הוא שטכניקה נפוץ שימש על mechanosensitive חלבונים בתוך8,הידבקויות מוקד31, צמתי adherens47, קליפת אקטין26, ואת גרעין48. לנוע קדימה, שהטכניקה FRAP סריג צריך להיות בהרחבה החלים על כל אלה חיישנים קיימים או לאחרונה פיתחה חיישנים, המאפשר המידות של דינמיקה רגישים ל"כוח הפזורים במגוון רחב של מבנים subcellular והקשרים. למטרה זאת, אנו מספקים נתונים היסטוריים, כללית פרוטוקול ליישום הטכניקה סריג-FRAP ישים במערכות שונות אלו. בתקווה, זה יאפשר מגוון רחב של ניסויים שחקרתי את התפקידים של חלבונים mechanosensitive שונים בוויסות כוח שידור, מתווכים בהתנהגות התא.
שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום המכונוביולוגיה, כגון כיצד כוחות מועברים ומו חשים בתוך תאים, כמו גם בין תאים וסביבתם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גישה למידע בקנה מידה מולקולרי לגבי האופן שבו חלבונים מגיבים לכוחות מכניים בתוך ההקשר המקומי של התא החי. למרות שיטה זו הוחלה במיוחד על לימוד וינקולין חלבון הידבקות המוקד, זה יכול להיות מיושם גם חלבונים אחרים רגישים מכנית, כגון טאלין, cadherins או nesprin.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כמו הגדרת הדמיה נכונה קשה אך הכרחי להצלחת הניתוח. התחל הליך זה עם ביטוי יציב של מבנה חיישן המתח בסוג התא הרצוי, כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי להכין מצעים עבור זריעת תאים, לרכוש ארבע מנות 35 מילימטר זכוכית תחתית.
עבודה במכסה המנוע של תאים, בצינור חרוט 15 מיליליטר, לעשות ארבעה מיליליטר של 10 מיקרוגרם למיליליטר fibronectin בתמיסת מלח סטרילית פוספט-buffered, או PBS. בעדינות להפוך את הצינור פעם אחת לערבב ולתת את הפתרון לשבת במשך חמש דקות במכסה המנוע של תא התרבות. ואז פיפטה מיליליטר אחד של פתרון פיברונקין על כל צלחת עם תחתית זכוכית.
השאירו את תספורת הפיברונאטין על הכלים למשך שעה בטמפרטורת החדר או למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. ואז לספירה את פתרון פיברונאטין ולשטוף פעם אחת עם PBS. השאירו מיליליטר אחד של PBS על הכלים עד התאים מוכנים לזרוע.
לאחר