蛍光技術の組み合わせを用いた生細胞内力感受性タンパク質ダイナミクスの測定

細胞外の環境は、細胞のふるまいを指示する生化学的および物理的な手がかりの豊富なソースです。特に、微小環境の物理的性質はキーの細胞などの細胞の増殖、移行、および分化^1,2,3,4を仲介することができます。制御の仕組みの不全、癌⁵、アテローム性動脈硬化の⁶、および線維症⁷などの適切な治療をしていない多くの病気に重要なコンポーネントです。細胞が物理的な刺激を生化学的に検出可能な信号に変換する方法を完全に理解、プロセス メカノトランスダクションと呼ばれる、力の伝達、細胞の内外の両方に関わる分子メカニズムの解明が必要ですし、複数細胞内構造体。

細胞レベル下の構造の中タンパク質は常に裏返し;バインドとバインドのパートナー⁸との相互作用の強さに基づいてバインド解除。物理的な距離間で正常に送信される力の蛋白質蛋白質の相互作用、タンパク質の代謝回転が維持し、そのバインディング パートナー⁹に力を伝達できるほど低速である必要があることを意味の切れ目のない連鎖があります。相互作用はしばしば異なる条件^10,の下で非連結状態に移行できるバインド済み状態として概念化蛋白質蛋白質の相互作用は一般のいくつか非共有結合性タンパク質のドメイン間をで構成、¹¹します特定の蛋白質蛋白質の相互作用の力がなし「理想的な絆」として知られている相互作用の寿命に影響を及ぼす、「スリップの絆」として知られている相互作用の有効期限を短縮または相互作用の寿命を延ばすことが可能だ。、「キャッチ絆」¹⁰として知られています。したがって、蛋白質負荷と我々 は敏感なダイナミクスとして参照する蛋白質ダイナミクスの複雑な関係があります。

結合ダイナミクスに及ぼす荷重の解明、分子レベルで非常に有益な実験の数を行った。孤立したタンパク質やタンパク質の原子間力顕微鏡光ピンセットや磁気ピンセットなど操作技術の断片を使用して、これらの研究は関連性の高いいくつかの敏感なタンパク質間相互作用を実証しています。タンパク質^11,12。両方インテグリン¹³とカドヘリン¹⁴、膜貫通タンパク質細胞マトリックスと細胞間の相互作用をそれぞれ形成のために重要であるロードによるダイナミクスの変化を示しています。細胞内ビンキュリンが¹⁵と α-カテニン¹⁶をタリンと両方に力依存的に募集し、アクチン¹⁷, ストレスファイバー (FAs)、アドヘレンスジャンクション (AJs ビンキュリンの重要な役割を示すキャッチ結合を形成することができます。) 負荷の下で。単一分子の研究特定タンパク質-タンパク質相互作用の分離を可能にする、彼らは細胞の環境の複雑さを考慮しない、明確な結果をもたらします。

画期的な実験実証 FAs、AJs を含む、いくつかの細胞内構造を受容が内部的に生成または外部から適用荷重^{18,19への応答で強化されたアセンブリを展示、 20,21,22}。さらに、いくつかの理論的モデルは、力感受性タンパク質ダイナミクス^23,24,25機械アセンブリを運転できることを示唆しています。生きた細胞内でこれらの敏感なダイナミクスを調べるいくつかの間接的なアプローチが取られています。縛ると関連技術は、細胞^26,27,28,29タンパク質の動態を測定するため比較的単純な方法論を提供します。ただし、蛋白質負荷の測定はより制限されています。典型的なアプローチは、タンパク質の動態と全体的な細胞収縮^8,30,31を減らすために使用される細胞骨格阻害剤への露出なしのセルを比較することです。概念的には、これは高負荷と低負荷の状態の比較です。ただし、いずれかの状態で蛋白質間で負荷の定量化がないと阻害剤, F-アクチン フィラメントに沿ってキー結合部位のような損失の生化学的な効果を意図しない可能性があります。別のアプローチは、FAs に固有は、分子の負荷を概算し、FA³²内の単一蛋白質の動態との関係を調べる牽引力顕微鏡を用いた FA による基板上の合計の力運動を測定してきました。このアプローチは、合計の力の定量化により、分子固有の情報は提供されません。FAs はロード³³を耐えることができる多くの以上の 200 の異なるタンパク質から成っています。したがって、可能性のある FA の力の合計出力の測定力伝送経路の複数の可能性が不明瞭、特定のタンパク質では負荷の測定を確実に提供されません。

フレット ベース張力センサーの出現により直接、メカノバイオロジーで従来のアプローチとは異なり細胞^34,35,36生活の中の特定のタンパク質によって発生する負荷の測定。タンパク質ダイナミクスの FRAP ベース メジャーとフレット ベース張力検出器を組み合わせたプロトコルを紹介します。我々 はフレット FRAP としてこの技法を参照してください。この方法は、蛋白質負荷と細胞 (図 1) の力感受性タンパク質ダイナミクスの評価をこのように蛋白質の原動力の同時測定できます。既に、フレット FRAP テクニックは機械的リンカー蛋白質ビンキュリン³⁷の敏感なダイナミクスの研究に適用されています。張力検出器は、様々 な細胞内構造に関連している多数の蛋白質のために開発されています。たとえば、センサーはビンキュリン タリンと^{34 38,39} FAs、カドヘリンと AJs^40,41,42, 複雑な核のバイオスで nesprin でカテニン発現で開発されています。⁴³α-アクチニン⁴⁴フィラミン³⁶骨格と、糖衣⁴⁵、他の中の MUC 1⁴⁶。同様に、FRAP は一般的に使用される手法は、焦点接着斑^8,31、単接合⁴⁷、アクチン皮質²⁶、および核⁴⁸内の機械受容蛋白質で使用されています。今後は、これらの既存のセンサーまたは新しくフレット FRAP 技術はいずれかに広く適用する必要がありますさまざまな細胞レベル下の構造およびコンテキストの敏感な現象の測定を可能にするセンサーを開発しました。この終わりに向かってフレット FRAP 手法適用これらの異なるシステムでの実装の詳細、一般化されたプロトコルを提供します。うまくいけば、これはさまざまな力の伝達を調節する、細胞の挙動を媒介に様々 な機械受容タンパク質の機能解明の実験になります。