살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

세포 외 셀 동작을 지정 하는 생 화 학적 및 물리적 단서의 풍부한 원천입니다. 특히,는 microenvironment의 물리적 특성 키 세포 기능, 세포 성장, 감 별 법^1,2,3,4, 마이그레이션, 등 중재 수 있습니다. microenvironment의 역학의 Dysregulation 아직 없는 암⁵, 아 테 롬⁶, 섬유 증⁷등 적절 한 치료는 많은 질병에 중요 한 구성 요소입니다. 세포 화학적 감지 신호에 물리적 자극을 변환 하는 방법의 완벽 한 이해, 프로세스 mechanotransduction 되 나, 필요 힘 전송, 모두에 세포에서 중재 하는 분자 메커니즘의 해명 및 내 여러 subcellular 구조.

Subcellular 구조, 내부 단백질은 지속적으로 선회; 바인딩 고 강도 바인딩 파트너⁸와 그들의 상호 작용에 따라 바인딩. 물리적 거리에 걸쳐 성공적으로 전송 될 세력 단백질 단백질 상호 작용, 단백질의 매출 유지 하 고 그것의 바인딩 파트너⁹힘을 전송 하는 속도가 느린 해야 의미의 파손 되지 않는 사슬 해야 합니다. 상호 작용 다른 조건^10, 에서 언바운드 상태로 전환 수 바인딩된 상태로 종종 개념 동안 단백질 단백질 상호 작용은 일반적으로의 여러 비-공유 결합 사이 단백질 도메인 구성, ¹¹. 주어진된 단백질-단백질 상호 작용을 위해 힘 "이상적인 본드" 라고 하는 상호 작용의 수명에 영향을, "슬립 본드" 라고 하는 상호 작용의 수명을 감소 또는 상호 작용의 수명을 늘릴 수는 가능 하다 "캐치 본드"¹⁰로 알려진. 따라서, 단백질 로드와 힘 민감한 역학 지칭 단백질 역동성 사이 복잡 한 관계가 이다.

채권 역학에 부하의 영향을 이해, 향해 매우 유익한 실험의 수 단일 분자 수준에서 수행 되었습니다. 고립 된 단백질, 또는 단백질 및 조작 기술이 자기 핀셋, 광학 핀셋, 원자 힘 현미경 검사 법의 파편을 사용 하 여,이 학문은 설명 했다 힘에 민감한 단백질 단백질 상호 작용에 관련 단백질^11,12. 두 integrins¹³ 및 cadherins¹⁴이 막 횡단 단백질 형성 세포-매트릭스와 세포 세포 상호 작용, 각각에 대 한 중요 한, 역학 때문에 변경 로드 설명 했다. 셀 내에, vinculin 힘 종속 방식에서 모두 중부¹⁵ 와 α-catenin¹⁶ 보충 하 고 말라¹⁷, 초점 유착 (FAs)와 외화 접합 (AJs에서 vinculin에 대 한 중요 한 역할을 나타내는 캐치 유대를 형성 수 있습니다. ) 부하. 단일 분자 연구 특정 단백질-단백질 상호 작용의 격리에 대 한 허용 하 고 모호 하지 않은 결과, 하지만 그들은 세포 환경의 복잡성에 대 한 계정을 하지 않습니다.

획기적인 실험 시연 AJs, FAs 등 여러 subcellular 구조, mechanosensitive, 고 전시 내부적으로 생성 또는 외부 적용 부하^{18,19에 향상 된 어셈블리 20,,2122}. 또한, 몇 가지 이론적 모델 mechanosensitive 어셈블리 힘에 민감한 단백질 역동성^23,,2425에 의해 구동 될 수 있는 제안 했다. 살아있는 세포 내에서 이러한 힘 민감한 역학 검사, 몇 가지 간접 접근 촬영 되었습니다. FRAP 및 관련된 기술 셀^26,27,,2829단백질 역학을 측정 하기 위한 비교적 간단한 방법론을 제공 합니다. 그러나, 단백질 부하의 측정 더 제한 되었습니다. 일반적인 방법은 셀 전체 세포 수축^8,,3031을 줄이기 위해 사용 cytoskeletal 억제제에 노출 없이 단백질 역동성을 비교할 것입니다. 개념적으로, 이것은 높은 부하와 낮은 부하 상태 사이의 비교입니다. 그러나, 거기 아무 정량화 부하의 단백질에서 어느 상태에 이며 억제제, F 걸 필 라 멘 트에 따라 키 바인딩 사이트의 손실 등의 의도 하지 않은 생 화 확 적인 효과 있을 수 있습니다. 또 다른 방법은, FAs, 관련 FA 견인 힘 현미경 검사 법을 사용 하 여 분자 부하 대략적인 FA³²내 단일 단백질의 역학 관계를 조사 하 여 기판에 총 힘 노력을 측정 하고있다. 총 힘의 부 량이 접근이 방식을 사용 하면, 그것은 분자로 특정 정보를 제공 하지 않습니다. FAs는 많은 부하³³을 견딜 수 있는 200 개 이상의 서로 다른 단백질의 구성 되어 있습니다. 따라서, 잠재적으로 FA의 총 힘 출력을 측정 여러 힘 전송 경로 가능성을 가린다 고 안정적으로 부하의 측정을 특정 단백질에 제공 하지 않습니다.

Mechanobiology에 이전 접근, 달리 무서 워 기반 긴장 센서의 출현 수 직접 생활 안에 특정 단백질에 의해 발생 하는 부하의 측정 셀^34,,3536. 여기, 선물이 FRAP 기반 측정 단백질 역동성의 긴장 초조해 기반 센서를 결합 하는 프로토콜. 우리 졸라 무서 워 서이 기술을 참조 하십시오. 이 방법은 단백질 부하 및 살아있는 세포 (그림 1)의 힘에 민감한 단백질 역학 평가 되므로 단백질 역동성의 동시 측정을 수 있습니다. 이미, 무서 워 졸라 기술 기계 링커 단백질 vinculin³⁷의 힘-민감한 역학의 연구에 적용 되었습니다. 장력 센서 다양 한 subcellular 구조에에서 관련 된 수많은 단백질을 위해 개발 되었습니다. 예를 들어 센서 vinculin³⁴ 와 중부^38,39 FAs, cadherins 및 AJs^40,,4142, 복잡 한 핵 링컨에서 nesprin에에서 catenins에 개발 되었습니다. ⁴³, α-actinin⁴⁴ , filamin³⁶ , 골격 및 MUC-1는 glycocalyx⁴⁵, 다른 사람 사이에⁴⁶. 마찬가지로, FRAP 초점 유착^8,31, 외화 접속점⁴⁷, 말라 피²⁶, 및 핵⁴⁸mechanosensitive 단백질에 일반적으로 사용 되는 기술 사용 되었습니다입니다. 이러한 기존의 센서 또는 새로 무서 워 졸라 기술에 광범위 하 게 적용 해야 앞으로, 이동 센서, 다양 한 subcellular 구조 및 상황에에서 힘 민감한 역학의 측정에 대 한 수 있도록 개발. 이 끝, 무서 워 졸라 기술 적용이 다른 시스템에 구현 하기 위한 상세한, 일반화 된 프로토콜을 제공 합니다. 바라 건 대,이 다양 한 실험 elucidating 다양 한 mechanosensitive 단백질 힘 전송 규제 및 셀 행동 중재의 역할을 수 있게 된다.