Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Måling av Force-Sensitive Protein dynamikk i levende celler ved hjelp av en kombinasjon av fluorescerende teknikker
Chapters
Summary November 2nd, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her presenterer vi en protokoll for samtidig bruk av han selvmord resonans energi overføring-basert spenning sensorer for å måle protein belastning og fluorescens gjenoppretting etter photobleaching å måle protein dynamics slik at måling av kraft-sensitive protein dynamikken i levende celler.
Transcript
Denne metoden kan svare på viktige spørsmål innen mekanobiologi, for eksempel hvordan krefter overføres og sanses i celler, så vel som mellom celler og deres miljø. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir tilgang til molekylær skalainformasjon om hvordan proteiner reagerer på mekaniske krefter i den opprinnelige konteksten til den levende cellen. Selv om denne metoden har blitt brukt spesielt til å studere fokal vedheft protein vinculin, det kan også brukes på andre mekanisk følsomme proteiner, som talin, kadheriner eller nesprin.
Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk, da riktig bildeoppsett er vanskelig, men nødvendig for analysens suksess. Start denne prosedyren med stabilt uttrykk for spenningssensoren konstruere i ønsket celletype, som beskrevet i tekstprotokollen. For å forberede substrater for cellesåing, skaff deg fire 35 millimeter glassbunnede retter.
Arbeider i en celle kultur hette, i en 15 milliliter konisk rør, lage fire milliliter på 10 mikrogram per milliliter fibronectin i steril fosfat-bufret saltløsning, eller PBS. Snu forsiktig røret en gang for å blande og la løsningen sitte i fem minutter i cellekulturhetten. Pipette deretter en milliliter fibronectin løsning på hver glassbunnet tallerken.
La fibronectinløsningen stå på oppvasken i en time ved romtemperatur eller over natten ved fire grader Celsius. Aspirer deretter fibronectinoppløsningen og skyll en gang med PBS. La en milliliter PBS på oppvasken til cellene er klare for såing.
Etter å ha talt cellene, frø 30, 000 celler på hver fibronectin-belagt glass rett med riktig komplett media for et endelig volum på 1,5 milliliter. La cellene spre seg i fire timer etter såing. Ved to timers spredning, aspirer vekstmediet og skyll en gang med bildemedier.
La det være 1,5 milliliter av bildemediet. Varm opp mikroskopet som beskrevet i tekstprotokollen før du begynner kalibreringen. For å kalibrere FRAP-laseren, må du først åpne laserkonfigurasjonsvinduet.
Sett Belysningsinnstillingen på de riktige FRAP-belysningsinnstillingene for lasereksponering for prøven. Sett deretter Belysningsinnstillingen til belysningsinnstillingene som bare passer for bildebehandling av den som er godkjent fluorofor. Velg målet for å kalibrere under Koordinatsysteminnstilling.
Fjern merket for Klikk kalibreringspunkter manuelt, og merk av for Vis bilder under kalibreringen. Sett oppholdstiden til 10 000 mikrosekunder og antall pulser til 100. Plasser kalibreringslysbildet, laget av ethidiumbromid forseglet mellom et glasssklie og en dekselslipp, inn i sceneadapteren med dekselet skli side ned.
Bruk innstillingene for belysning av acceptor til å fokusere på overflaten av lysbildet, identifiserbar som fokalplanet med det lyseste signalet. Små defekter i belegget vil være synlige for å hjelpe til med å fokusere. Flytt lysbildet til et område med jevn fluorescens over bildeplanet.
Klikk på Opprett innstilling for første kalibrering eller oppdateringsinnstilling for etterfølgende kalibreringer. Programvaren vil initialisere kalibreringsprosessen, automatisk bleking og oppdage plasseringen av bleket punkt. Sikre en vellykket kalibrering ved å vurdere det endelige bildet, som vil være et tre-tre rutenett av blekede punkter som skal fordeles jevnt og i fokus.
Lagre kalibreringsbildet for fremtidig referanse. Fjern kalibreringslysbildet og oppbevar det på en trygg måte. Kalibrering bør utføres før du begynner hvert eksperiment, men trenger ikke å utføres mellom prøvene.
Forbered mikroskopioppsettet for levende celleavbildning, helst med et oppvarmet stadium og mål, samt en karbondioksidkontroll. La det likevekte i 20 minutter. Plasser nå et av de genererte prøvene av celler som uttrykker spenningssensoren i mikroskopholderen for bildebehandling.
La cellene likevekte i 10 minutter. For å sikre helsen til de avbildede cellene, oppretthold temperaturen ved 37 grader Celsius i bildekammeret. Bruk en peristaltisk pumpe til å passere fuktet 5% karbondioksid over prøvene ved 15 milliliter per minutt for å opprettholde pH.
Åpne verktøyet Flerdimensjonal anskaffelse eller MDA, og konfigurer det med FRET-bildeparametere, inkludert de forskjellige filtersettene. Lagre denne MDA i eksperimentell mappe med navnet MDA_FRET_date. Konfigurer en annen MDA med FRAP-bildeparameterne, inkludert de forskjellige filtersettene, Timelapse-innstillingene og Journal for å pulsere laseren etter kjøp før blekemiddel.
Lagre denne MDA i eksperimentell mappe med navnet MDA_FRAP_date. Velg Journal, Start opptak på verktøylinjen øverst på skjermen. Åpne MDA-vinduet, last inn MDA_FRET_date og trykk på Hent.
Last deretter inn MDA_FRAP_date og trykk på Hent. Velg Journal, Stopp opptak på verktøylinjen øverst på skjermen på slutten av oppkjøpet. Lagre denne journalen i eksperimentell mappe med navnet på FRETFRAP_date og legg den til på en verktøylinje for enkel tilgang.
Lukk MDA-vinduet. Naviger i eksemplet ved hjelp av bildeanskaffelsen under Hent, Hent med minimal eksponeringstid og nøytral tetthetsfilter for å identifisere interessecellene. Angi kontinuerlig autofokus ved å navigere til Enheter, Fokus.
Fokuser prøven manuelt til den når riktig bildeplan. Klikk Angi kontinuerlig fokus, og vent til systemet skal justeres. Når systemet er justert, klikker du start kontinuerlig fokusering.
Deretter finner du en celle som uttrykker spenningssensoren med klar lokalisering til en struktur av interesse og knipser et bilde. Tegn et rektangulært område av interesse, eller avkastning, for å markere hvor du skal bleke. Lagre denne avkastningsplasseringen.
Nå initialisere FRETFRAP_date journal, som vil begynne oppkjøpet av FRET-bilder, etterfulgt av initialiseringen av FRAP timelapse. Gjenta disse trinnene til 10 til 15 bildesett er anskaffet. Analyser deretter FRET-FRAP-dataene som beskrevet i tekstprotokollen.
Vist her er representative resultater for FRET-avbildning av vinculinspenningssensoren, etter segmentering og maskering for å isolere fokale adhesjoner. Spacial variasjon av vinculin belastning kan sees over cellen. FRAP-bildebehandling og analyse kan påvirkes av stabilitet i fokal vedheft.
En fokal vedheft som forekom raskt i bildeperioden kan være vanskelig å spore nøyaktig. Ofte indikeres dette av en FRAP-kurve som inneholder diskontinuiteter og ikke-interaktiv. For en vill-type vinculin er det en omvendt sammenheng mellom proteinbelastning og omsetningshastighet, noe som indikerer at vinculin stabiliseres med kraft.
Innføring av en mutasjon i vinculin for å påvirke bindingen til talin resulterer i en reversering av korrelasjonen, noe som indikerer at vinculin som ikke er i stand til å binde talin, destabiliseres med kraft. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å forberede prøver riktig, sikre at cellene uttrykker sensoren på endogene nivåer og velger bildeparametere nøye. Etter denne prosedyren kan andre metoder som immunofluorescence, måling av cellulær skaladynamikk eller utfordrende celler med ulike hemmere utføres for å svare på flere spørsmål som hvordan proteinet av interesse samhandler med andre subcellulære komponenter for å koordinere respons på kraft.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
