Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Måling af kraft-følsom Protein Dynamics i levende celler ved hjælp af en kombination af fluorescerende teknikker
Chapters
Summary November 2nd, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer her, en protokol til den samtidige brug af Förster resonans energi transfer-baseret spænding sensorer til at måle protein belastning og fluorescens opsving efter photobleaching til at måle protein dynamics muliggør måling af kraft-følsom protein dynamikken i levende celler.
Transcript
Denne metode kan besvare centrale spørgsmål inden for mekanobiologi, såsom hvordan kræfter overføres og fornemmes i celler såvel som mellem celler og deres miljø. Den største fordel ved denne teknik er, at den giver adgang til den molekylære skala information om, hvordan proteiner reagerer på mekaniske kræfter inde i den oprindelige sammenhæng af den levende celle. Selv om denne metode er blevet anvendt specifikt til at studere fokal vedhæftning protein vinculin, det kan også anvendes på andre mekanisk følsomme proteiner, såsom talin, cadherins eller nesprin.
Visuel demonstration af denne metode er kritisk, da korrekt billedbehandling setup er vanskeligt, men nødvendigt for en vellykket analyse. Begynd denne procedure med stabilt udtryk for spændingssensorkonstruktionen i den ønskede celletype, som beskrevet i tekstprotokollen. For at forberede substrater til cellesåning, erhverve fire 35 millimeter glasbundede retter.
Når du arbejder i en cellekulturhætte i et 15 milliliter konisk rør, dannes der fire milliliter 10 mikrogram pr. milliliter fibronectin i steril fosfatbunet saltvandsopløsning eller PBS. Inverter forsigtigt røret én gang for at blande og lad opløsningen sidde i fem minutter i cellekulturhætten. Derefter pipette en milliliter fibronectin opløsning på hver glasbundet skål.
Lad fibronectinopløsningen være på opvasken i en time ved stuetemperatur eller natten over ved fire grader Celsius. Derefter aspirere fibronectinopløsningen og skyl én gang med PBS. Lad en milliliter PBS blive på opvasken, indtil cellerne er klar til såning.
Efter optælling af cellerne, frø 30, 000 celler på hver fibronectin-belagt glas fad med passende komplette medier til et endeligt volumen på 1,5 milliliter. Lad cellerne sprede sig i fire timer efter såning. Ved to timers spredning aspirere vækstmedierne og skyl én gang med billedbehandlingsmedier.
Lad 1,5 milliliter af billedmediet. Varm mikroskopet op som beskrevet i tekstprotokollen, før kalibreringen påbegyndes. Hvis du vil kalibrere FRAP-laseren, skal du først åbne laserkonfigurationsvinduet.
Indstil belysningsindstillingen til de relevante FRAP-belysningsindstillinger for lasereksponering for prøven. Indstil derefter Belysningsindstillingen til de belysningsindstillinger, der passer til billeddannelse, kun acceptorinorfluorinophore. Vælg den målsætning, der skal kalibreres under Indstillingen Koordinatsystem.
Fjern markeringen ved klik manuelt på kalibreringspunkter, og markér Vis billeder under kalibrering. Indstil dvæletiden til 10.000 mikrosekunder og antallet af impulser til 100. Nu placere kalibrering dias, lavet af ethidium bromid forseglet mellem et glas dias og et dæksel slip, i scenen adapter med dækslet glide side ned.
Brug acceptorbelysningsindstillingerne til at fokusere på diasets overflade, der kan identificeres som brændplanet med det klareste signal. Små fejl i belægningen vil være synlige for støtte i fokusering. Flyt diaset til et område med ensartet fluorescens hen over billedplanet.
Klik på Opret indstilling for den første kalibrering eller opdateringsindstilling for efterfølgende kalibreringer. Softwaren vil initialisere kalibreringsprocessen, automatisk blegning og detektere placeringen af det blegede punkt. Sikre en vellykket kalibrering ved at vurdere det endelige billede, som vil være en tre-af-tre gitter af blegede punkter, der bør være jævnt fordelt og i fokus.
Gem kalibreringsbilledet til senere brug. Fjern kalibreringssliden, og opbevar dem sikkert. Kalibrering skal udføres, før hvert forsøg påbegyndes, men det er ikke nødvendigt at udføre mellem prøverne.
Forbered mikroskopi opsætningen til levende celle billeddannelse, helst med en opvarmet fase og mål, samt en kuldioxid kontrol. Lad det ækvivalere i 20 minutter. Placer nu en af de genererede prøver af celler, der udtrykker spændingssensoren, i mikroskopholderen til billeddannelse.
Lad cellerne ækvilibre i 10 minutter. For at sikre de afbildede cellers sundhed skal temperaturen opretholdes ved 37 grader Celsius i billedkammeret. Brug en peristaltisk pumpe til at passere befugtet 5% kuldioxid over prøverne ved 15 milliliter i minuttet for at opretholde pH.
Åbn værktøjet Multi-Dimensional Acquisition eller MDA, og konfigurer det med FRET-billeddiagnostiske parametre, herunder de forskellige filtersæt. Gem denne MDA i den eksperimentelle mappe med navnet MDA_FRET_date. Opret en anden MDA med FRAP-billeddannelsesparametrene, herunder de forskellige filtersæt, Timelapse-indstillingerne og Journal for at pulsere laseren efter før-blegemiddeltilegnelse.
Gem denne MDA i eksperimentmappen med navnet MDA_FRAP_date. Vælg Journal og derefter på værktøjslinjen øverst på skærmen. Åbn MDA-vinduet, indlæs MDA_FRET_date og tryk på Hent.
Indlæs derefter MDA_FRAP_date og tryk på Hent. I slutningen af købet, på værktøjslinjen øverst på skærmen, skal du vælge Journal, Stop optagelse. Gem denne journal i den eksperimentelle mappe med navnet på FRETFRAP_date og føj den til en værktøjslinje, så den er nem at få adgang til.
Luk MDA-vinduet. Naviger i eksemplet ved hjælp af billedets anskaffelse under Hent, Hent med minimal eksponeringstid og filter med neutral tæthed for at identificere de celler, der er af interesse. Indstil kontinuerlig autofokus ved at navigere til Enheder, Fokus.
Fokuser manuelt på prøven, indtil den når det korrekte billedplan. Klik på Angiv kontinuerlig fokus, og vent på, at systemet justeres. Når systemet er justeret, skal du klikke på Start kontinuerlig fokusering.
Find derefter en celle, der udtrykker spændingssensoren med klar lokalisering til en struktur af interesse, og tag et billede. Tegn en rektangulær region af interesse, eller ROI, for at fremhæve, hvor at blege. Gem denne roi-placering.
Nu initialisere FRETFRAP_date tidsskrift, som vil begynde erhvervelsen af FRET billeder, efterfulgt af initialiseringen af FRAP timelapse. Gentag disse trin, indtil der anskaffes 10 til 15 billedsæt. Analyser derefter FRET-FRAP-dataene som beskrevet i tekstprotokollen.
Vist her er repræsentative resultater for FRET billeddannelse af vinkulin spændingssensoren, efter segmentering og maskering for at isolere fokale sammenvoksninger. Spacial variation af vinculin belastning kan ses på tværs af cellen. FRAP billeddannelse og analyse kan påvirkes af fokal vedhæftningstabilitet.
En fokal vedhæftning, der translokerer hurtigt i billeddiagnostiske periode, kan være vanskelig at spore præcist. Ofte er dette angivet med en FRAP kurve, der indeholder diskontinuiteter og i uinteressant. For en vild-type vinculin, er der en omvendt sammenhæng mellem protein belastning og omsætning sats, hvilket indikerer, at vinkulin er stabiliseret med magt.
Indførelse af en mutation i vinculin at foretage sin binding til talin resulterer i en vending af korrelationen, hvilket indikerer, at vinkulin, der ikke er i stand til at binde talin er destabiliseret med magt. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske at forberede prøver ordentligt, sikre, at cellerne udtrykker sensoren på endogene niveauer og vælge billeddannelse parametre omhyggeligt. Efter denne procedure, andre metoder som immunfluorescens, måling cellulære skala dynamik eller udfordrende celler med forskellige hæmmere kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål som hvordan protein af interesse interagerer med andre subcellulære komponenter til at koordinere respons på kraft.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
