8,498 Views
•
07:58 min
•
March 06, 2019
DOI:
Denna metod kan svara på viktiga frågor om NK-cellreceptorgenetik som haplotypmångfald och hur detta relaterar till sjukdom. Visuell demonstration av denna metod kommer att bidra till att ställa in protokollet i ditt laboratorium, inklusive automatiseringsprocessen och dataanalys. De viktigaste fördelarna med denna teknik är att, till skillnad från konventionella metoder, qKAT, som står för kvantitativa KIR automatiserad skriva, är hög-genomströmning och det ger genkopiering nummer.
qKAT kan ge insikt i sjukdomsassociation. Konsekvenserna av denna teknik kan vara användbara för terapi för virusinfektioner som HIV och hepatit C, i cancer, i stamcellstransplantation, och graviditetsstörningar. qKAT kan också tillämpas i att studera populationsgenetik samt utforska uttryck och funktionella interaktioner mellan KIR och HLA-molekyler.
qKAT består av 10 multiplexreaktioner som specifikt riktar exons av de två KIR-generna och en referensgen. I detta protokoll, specifika primers är utformade för att upptäcka allelerna i den givna genen och PCR resultat i korta amplikoner. Efter detta används dubbelmärkta specifika hydrolysprober för att övervaka PCR-förstärkningen i realtid.
Kopiera numrerar analys använder släktingkvantifiering av de kir generna för uppsätta som mål till en hänvisa till gen. qKAT är utformat och inställt för att vara en teknik med hög genomströmning. Därav kan varje reaktion utföras på strax under 1, 000 prover.
Följande steg visar de steg som är inblandade i beredningen och plätering av varje 96-väl DNA-platta. Till att börja, efter att kvantifiera DNA, späd DNA i en 96-väl djup-väl platta. Inkludera minst ett kontrollprov med ett känt kopieringsnummer och en kontroll som inte är mall.
Centrifugera plattan vid 450 gs i två minuter. Därefter dispensera varje prov i fyrdubbla till 384-brunns qPCR-plattor. Efter detta lufttorkar DNA:t i ett rent område i rumstemperatur i 24 timmar.
För att ställa in en qKAT-reaktion för 10 384-brunnsplattor, först, tina qPCR-bufferten, primer och probe alikvoter vid fyra grader Celsius. Förbered mastermixen på is enligt textprotokollet. Använd sedan en flerkanalspipett för att fördela mastermixen jämnt över en 96-väl djup-brunnsplatta.
Dispensera 9,5 mikroliter av masterblandningen i varje brunn av plattan med de torkade gDNA-proven. Efter detta, försegla plattan med folie och omedelbart lagra den i fyra grader Celsius. Kom ihåg att utföra en kort vattentvätt för att rengöra nålarna i vätskehanteringssystemet om dispensering master mix på mer än en 384-väl DNA-platta.
Centrifugera plattan med gDNA-proven vid 450 gs i tre minuter. Sedan, inkubera plattan vid 4 grader Celsius för att återanvända DNA och avleda eventuella luftbubblor. Efter inkuberingen av plattan över natten, upprepa centrifugeringen för att avleda eventuella luftbubblor.
Placera sedan plattan i den kylda förvaringsdockan. Anslut qPCR-maskinen till en mikroplatthanterare. Sedan programmerar du mikroplatthanteraren enligt textprotokollet.
När körningen är klar, har roboten samla plattan från qPCR maskinen och placera den i kasta dockan. Öppna programmet qPCR efter att ha slutfört förstärkningen. Öppna filen för sparade reaktionsexperiment för en platta under fliken Navigatör.
Därefter öppnar du fönstret Skapa ny analys och välj lämpliga inställningar för 2nd Derivative Max-metoden. Välj sedan Filter Comb och se till att de data som samlas in för STAT6 är vald. Välj lämplig färgkompensering.
Klicka på Beräkna och sedan på spara fil. Om du vill analysera data med metoden Anpassa punkter öppnar du fönstret Skapa ny analys och väljer lämpliga inställningar för metoden Anpassa poäng. Välj sedan rätt filter och färgkompensation för STAT6.
Ställ in brusbandet för att utesluta bakgrundsljudet. Efter detta öppnar du fliken Analys och ställer in passningspunkterna till tre, och väljer Visa inställningar. Spara ändringar och upprepa stegen med lämpliga inställningar för Fit Point och 2nd Derivative-analys för KIR-generna.
Öppna fliken Navigator i programvaran för qPCR och välj Resultat Batchexport. Öppna sedan mappen som innehåller experimentfilerna och överför dem till fönstrets högra sida. Klicka på Nästa och välj exportfilens namn och plats.
Efter detta väljer du analystypen av intresse och klickar på Nästa. Se till att namnet på filen, exportmappen och analystypen är korrekta innan du klickar på Nästa för att starta exportprocessen. När exportstatusen ändras till OK kommer skärmen automatiskt att flyttas till nästa steg.
Se till att alla de markerade filerna har exporterats utan framgång och klicka på Klar. Använd sedan skripten i textprotokollet för att dela upp de exporterade plattorna i individuella reaktioner och för att omvandla filerna till en programvara som kan läsas av programvara för kopieringsnummeranalys. Därefter öppnar du programvaran för analys av kopieringsnummer och väljer Importera PCR-resultatfil i realtid för att läsa in de textfiler som skapas av skripten.
Slutligen väljer du Analysera och genomför analysen genom att välja Mest frekventa provkopiantal. I detta protokoll användes halvautomatisk maskinskrivning, eller qKAT, för att kopiera nummertyp KIR-gener. Det vanligaste kopieringsnumret för KIR2DL4 var två kopior medan det mest frekventa kopieringsnumret för KIR3DS1 var noll.
Samtidigt som man försöker detta förfarande, är det oerhört viktigt att se till att DNA kvantifieras exakt, att genomföra alla steg på is, och att se till att reagenserna är täckta från ljus. Det är också viktigt att göra noggranna kontroller av rådata för prover som inte överensstämmer med de kända LD-reglerna för KIR-gener. Efter detta förfarande, andra metoder som sekvensering kan utföras för att besvara ytterligare frågor, till exempel, närvaro av fusion gener, eller identifiering av nya alleler.
Efter dess utveckling banade denna metod väg för forskare inom området immunogenetik att utforska KIR:s roll i NK-cellbiologi, sjukdomsresistens och mänsklig reproduktion.
Kvantitativa killer cell immunglobulin-like receptor (KIR) halvautomatisk maskinskrivning (qKAT) är en enkel, hög genomströmning och kostnadseffektiv metod för att kopiera nummer typ KIR gener för deras tillämpning i befolkningen och sjukdom associationsstudier.
Read Article
Cite this Article
Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).
Copy