Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Samtidige kvantificering af anti-vektor og Anti-transgen-specifikke CD8+ T celler Via MHC Tetramer farvning efter Vaccination med en Viral vektor
Chapters
Summary November 28th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer her, en protokol for ex vivo kvalitativ påvisning af antigen-specifikke CD8+ T celler. Analyse er muligt med enkelt celle udvisninger fra organer eller fra små mængder af blod. En bred vifte af undersøgelser kræver analyse af cytotoksiske T-celle svar (vaccination og cancer immunterapi undersøgelser).
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål inden for T-celle immunologi og udvikling af virale vektor vacciner. Den største fordel ved denne metode er, at kun små mængder blod er nødvendige, som giver mulighed for gentagne målinger fra den samme mus. Derudover kan virus- og transgenespecifikke CTL'er detekteres fra den samme prøve.
Demonstration af proceduren vil være Jasmine Rinnofner, en tekniker, og Annika Rossler, en grad studerende. Måling og analyse af prøverne vil være Zoltan Banki, en post-doc. Til at begynde, sikkert begrænse en mus i henhold til tekstprotokollen.
Saml 20 mikroliter blod i et EDTA-belagt rør fra en mus' haleåre. Når du arbejder med miltcytter, isolere milten og bruge stemplet af en sprøjte til at presse vævet gennem en celle si. Efter at have udført lysis på erythrocytterne, tælle cellerne og justere koncentrationen af prøven.
Der klargør og etiketter et Facs-rør til hver prøve, og overfør 100 mikroliter af organaffjedring eller 20 mikroliter blod til røret. Når du arbejder med miltcytter, centrifuge organ suspension i fem minutter, og kassér supernatant. Derefter vortex røret til at resuspendre cellen pellet.
For hver kanal, der skal anvendes, skal du også forberede et Facs-rør til en kompensationsprøve. Forbered endnu en prøve som et ukontrolleret kontrolelement. Forbered et rør med Facs buffere med tetramers på deres optimale fortyndinger, og vortex at blande.
Dernæst tilsættes 50 mikroliter af tetramerfortyndingen til hver prøve og vortex til at blande. Tilføj Facs-buffer uden tetramers til kompensationskontrollerne og den ikke-ained prøve. Dernæst inkubere prøverne i mørke forhold ved 37 grader Celsius i 20 minutter.
Mens prøverne inkuberes, tilsættes Facs buffer til et rør. Derefter tilsættes antistofferne til bufferen i henhold til de fortyndinger, der er angivet i tabel 2 i tekstprotokollen, og vortex opløsningen. I tvivl om det videnskabelige spørgsmål er markørkombinationer, bortset fra den, der er beskrevet her, kan anvendes.
Sørg for altid at inkludere antistoffer mod CD3 og CD8 i panelet. For hver kanal, forberede et rør med 200 mikroliter af Facs buffer, og tilsæt en mikroliter af et antistof fortynding mod CD8 i deres respektive farve, og vortex at blande. Gem derefter antistoffortyndingerne som angivet i tekstprotokollen.
For at vaske prøverne, tilføje en mililiter af Facs buffer til prøverne og centrifuge. Derefter kasseres supernatant, og dræne eventuelle resterende væske med papirservietter. Når du arbejder med blod, skal du være forsigtig, når du dræner resterende væske.
Før lysis af erythrocytter, blodet vil ikke holde sig til bunden af røret. Alternativt kan du aspirere supernatant. Dernæst tilsættes 50 mikroliter af antistofopløsningen til hver cellepellet og vortex forsigtigt.
Tilføj 50 mikroliter af hver kompensationsblanding til den tilsvarende kompensationskontrol og 50 mikroliter Facs-buffer til cellepillerne i den uhæmmede kontrol og vortex forsigtigt. Når der arbejdes med miltcytter, vaskes prøverne efter antistoffarvning direkte med en til to milliliter Facs buffer og centrifugeres i fem minutter. Derefter kasseres supernatant og afløb den resterende væske på papirservietter.
Tilføj 500 mikroliter af ACK buffer til hver blodprøve, og vortex forsigtigt. Derefter inkuberes prøverne i mørke i fem minutter ved stuetemperatur. Tilføj en milliliter Facs buffer til prøverne, og centrifuge.
Derefter kasseres supernatant og dræne eventuelle resterende væske med papirservietter. Korrekt lysis af erythrocytter er et afgørende skridt til at lette Facs måling, derfor, når pellet er temmelig våd, gentag lysis af erythrocytter. Prøverne vaskes igen som tidligere beskrevet.
Derefter kasseres supernatant og dræne eventuelle resterende væske på en køkkenrulle. Før fiksering skal du sørge for, at cellerne er godt resuspenderet for at forhindre dannelse af klumper. Tilføj 150 til 300 mikroliter af Facs fastsættelse buffer til hvert rør, og vortex at blande.
Fortsæt derefter med flowcytometrisk måling så hurtigt som muligt. For det første skal du måle kompensationskontrollen og korrigere for eventuelle spektrale overlapninger. Derefter skal du oprette sekventielle porte for at vælge til CD3-positive og CD8-positive celler.
Gate på lymfocytter ved hjælp af fremad og sidead scatter område. Derefter, inden for lymfocytpopulationen, gate på enkelte celler ved hjælp af fremad scatter bredde versus område. Brug CD3- og CD8-kanaler til at afbilde encellede lymfocytter.
Identificer CD8-positive T-celler ved at gating på CD3-positive og CD8-positive celler. Sørg for, at CD8-lave celler er inkluderet i gating. Overførsel på CD3/CD8-positive celler er et kritisk trin i denne protokol.
Da aktivering af celler ofte fører til nedregulering af CD3 og/eller CD8, bør CD3/CD8-lave celler også medtages. Derefter afbildes cd8-positive celler i forhold til tetramercellerne, gating på cd8-positive/tetramer-positive celler. Hvis det er muligt, skal du optage 20.000 celler i cd3-positiv og CD8-positiv port for hver prøve.
Endelig skal du gemme målingerne som en FCS-fil. I denne protokol blev antigenspecifik CD8+T-celler kvantitativt påvist i blod- og vævsprøver. Efter gating cd3-positive og CD8-positive celler blev der identificeret tetramer-positive celler.
To forskellige tetramers blev kombineret i samme rør til farvning, hvilket giver mulighed for samtidig kvantificering af to forskellige CTL-specificiteter. Ved hjælp af denne protokol kan T-celleresponser fra den samme mus følges over tid, da der kun er behov for små mængder blod til hver måling. Derudover kan fænotyper af antigenspecifikke CTLs analyseres.
Mens du forsøger denne procedure, Er det vigtigt at undgå langvarige inkubation gange, da dette kan føre til internalisering af T-celle receptorer. Siden opdagelsen af tetramerteknologi er tetramerfarvning blevet et vigtigt redskab til T-celleanalyse og en bred vifte af anvendelser, som omfatter tetramers, der påløber. En lys fremtid for lyse tetramers.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
