Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Visualisering av 3D hvit fettvev struktur med hele-mount flekker
Chapters
Summary November 17th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fokus for studien er å vise hele-mount immunostai- og visualisering teknikken som en ideell metode for 3D-bildebehandling av fettvev arkitektur og cellular komponenten.
Transcript
Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i fettbiologifeltet, for eksempel hvordan intercellulære interaksjoner og fettvevfysiologi endres på ulike metabolske forhold som faste og fedme. Den største fordelen med denne teknikken er at den optimalt bevarer den opprinnelige fett 3D-strukturen og unngår lange behandlingstrinn som vanligvis kreves for konvensjonell immunohistochemistry. Selv om denne metoden kan gi innsikt i strukturen i fettvevet, kan den også brukes på andre organsystemer, for eksempel nervesystemet, ved å farge hjernen.
Generelt vil personer som er nye på denne metoden, slite på grunn av vanskelighetene med å få eiendomsvevssteder, finne riktig fikseringsperiode og de optimale antistoffkonsentrasjonene. Etter at disseksjonen er fullført, overfører du parabolen som inneholder vevsprøvene i 1% paraformaldehyd fra isen til romtemperatur i en time. Deretter overfører vevet til enten en 12 eller 24-brønns cellekulturplate for raskere vask.
Det er viktig å huske at fargeprosedyren for hele fjellet må begynne umiddelbart etter disseksjon, og at det ikke er noen pausepunkter mellom hvert trinn. Vask vevet med PBS-0,3T på en shaker vippet ved 22 grader med en hastighet mellom 20 og 25 vipper per minutt ved romtemperatur i fem minutter. Gjenta denne vasken to ekstra ganger.
Etter dette legger du til omtrent 0,5 til en milliliter blokkeringsbuffer som inneholder 5% dyreserum. Inkuber platen på en shaker ved hjelp av de tidligere forholdene i en time. Aspirer blokkeringsløsningen, og legg til milliliter primære antistoffer fortynnet i PBS-0,3T med 1% dyreserum til hver brønn.
Inkuber platen over natten på en shaker ved fire grader Celsius med en tilt på 22 grader og en hastighet på 20 til 25 vipper per minutt. Neste dag, bruk PBS-0,3T til å vaske vevet ved romtemperatur i fem minutter. Gjenta denne vasken to ekstra ganger.
Deretter legger du til mellom 0,5 og en milliliter passende og fortynnet sekundære antistoffløsninger til hver brønn. Pakk platen i aluminiumsfolie og inkuber den på en shaker ved romtemperatur i en time. Etter dette vasker du platen to ganger med PBS-0,3T ved romtemperatur i fem minutter per vask.
Hvis visualisering av væskedråper er nødvendig under den nøytrale lipidflekken, vask to ganger med 1x PBS med hver vask som varer i fem minutter. Tilsett den nøytrale lipidflekken fortynnet i PBS, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. For å begynne å bilde, bruk tang til å legge vevet flatt på en 24 med 60 millimeter glassdekselslipp.
Hvis det er ønskelig med kjernefarging med DAPI, legger du til en til to dråper av et monteringsmedium som inneholder DAPI for å senke vevet helt ned og forhindre at det tørker. Plasser deretter lysbildet på et omvendt konokalt lasermikroskopsystem. For å få bilder av helmontert farget vev ved flere fokalplan, utfør Z-stabler på 100 til 150 mikrometer i dybden med trinnstørrelse på fire til seks mikrometer ved ønsket forstørrelse.
I denne studien brukes full-mount farging til å bevare fettvev arkitektur. I motsetning til metoder som involverer flere behandlingstrinn og snitting, noe som kan føre til vansiring av fettvevsmorfologien, kan full-mount farging metoden bevare morfologien av adipocytter, noe som sikrer nøyaktighet når du tolker resultater. Overfixation av fettvev fører til fikserings-indusert fluorescens, som kan indikeres ved overlappende identiske regioner, for eksempel i tyrosinhydroksylase og PECAM-1 signaler sett her.
Riktig faste, helmonterte flekkprøver viser imidlertid separate og tydelige signaler, noe som indikerer at disse signalene ikke er autofluorescence. Imaging hel-mount farget fettvev gir kvantifisering av morfologiske endringer under ulike eksperimentelle forhold. Spesielt er fettvev svært vaskularisert, noe som er viktig for å mege metabolsk homeostase ved raske endringer i energinivået.
For eksempel viser C57 svarte 6J-mus, som gjennomgår 24 timers faste, en betydelig mindre adipocyttstørrelse, noe som indikerer lipolyse, og en trend i forhøyet blodkartetthet sammenlignet med kontinuerlig matet mus. Rydding av fettvev med iDISCO+gjør det mulig for fettvev å bli optisk gjennomsiktig. Immunolabeling av fettvev som har gått gjennom vevsrydding viser mye tyngre nevrale arborisering sammenlignet med det som observeres i full-mount farging uten vevrydding ved samme forstørrelse.
Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å ikke overfix prøvene i mer enn en time ved romtemperatur i PFA, ellers vil dette øke bakgrunnen autofluorescence. Denne fikseringsperioden kan imidlertid forlenges hvis prøvene er festet til fire grader Celsius. Etter denne prosedyren kan andre metoder som kvantifisering ved hjelp av ImageJ utføres for å svare på flere spørsmål, for eksempel hvordan cellulær arkitektur, for eksempel adipocytesteder og blodkartetthet, endres som svar på ulike fysiologiske forhold.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
