Biology
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三维白色脂肪组织结构的全装染色可视化
Chapters
Summary November 17th, 2018
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本研究的重点是展示全安装免疫染色和可视化技术作为一种理想的方法, 为脂肪组织结构和细胞成分的三维成像。
Transcript
这种方法可以帮助回答脂肪生物学领域的关键问题，如细胞间相互作用和脂肪组织生理学在禁食和肥胖等不同代谢条件下如何变化。该技术的主要优点是，它以最佳方式保留了原有的脂肪3D结构，避免了传统免疫组织化学通常需要的冗长的处理步骤。虽然这种方法可以提供对脂肪组织结构的洞察，它也可以通过全安装染色大脑而应用于其他器官系统，如神经系统。
一般来说，由于难以获得财产组织位点、找到合适的固定期和最佳抗体浓度，对这种方法的个体将难以克服。解剖完成后，将含有1%甲醛组织样品的培养皿从冰中转移到室温一小时。然后将组织转移到12或24井细胞培养板，以更快地进行清洗。
重要的是要记住，全安装染色过程必须在解剖后立即开始，并且每个步骤之间没有暂停点。用 PBS-0.3T 在倾斜 22 度的摇床上清洗组织，在室温下以每分钟 20 至 25 次的速度倾斜 5 分钟。重复两次此洗涤。
在此之后，加入约0.5至1毫升含有5%动物血清的阻断缓冲液。使用以前的条件在摇床上孵育板一小时。吸气阻断溶液，并添加在PBS-0.3T中稀释的毫升原抗体，每井含有1%的动物血清。
在4摄氏度的摇床上孵育板，倾斜22度，速度为每分钟20至25度。第二天，使用PBS-0.3T在室温下清洗组织五分钟。重复两次此洗涤。
然后，向每一井添加0.5至1毫升适当和稀释的二级抗体溶液。用铝箔包裹板，并在室温下在摇床上孵育一小时。在此之后，用PBS-0.3T在室温下清洗盘子两次，每次洗涤5分钟。
如果在中性脂质污渍期间需要液滴的可视化，用 1x PBS 洗涤两次，每次洗涤持续 5 分钟。加入在PBS中稀释的中性脂质污渍，在室温下孵育30分钟。要开始成像，请使用钳子将组织平放在 24 由 60 毫米玻璃盖滑上。
如果需要使用 DAPI 进行核染色，请添加一到两滴含有 DAPI 的安装介质，以完全淹没组织并防止其干燥。然后，将幻灯片放在倒置的共体激光显微镜系统中。要在多个焦平面上获取全安装染色组织的图像，请执行 100 到 150 微米的 Z 堆栈，步长为 4 到 6 微米，达到所需的放大倍率。
在这项研究中，全安装染色用于保存脂肪组织结构。与涉及多个处理步骤和分节的方法不同，全安装染色方法可以保留脂肪细胞的形态，确保解释结果的准确性。脂肪组织过度固定导致固定诱导荧光，这可以通过重叠的相同区域来表示，例如这里看到的酪氨酸羟基酶和PECAM-1信号。
然而，正确固定的全安装污渍样品显示独立和不同的信号，表明这些信号不是自动荧光。成像全安装染色脂肪组织允许在不同的实验条件下定量形态变化。特别是，脂肪组织是高度血管化的，在能量水平的快速变化中，对促进代谢平衡非常重要。
例如，C57黑色6J小鼠，经过24小时的禁食，显示明显较小的脂肪细胞大小，这表明脂解，和血管密度上升的趋势相比，连续喂养的小鼠。使用 iDISCO® 清除脂肪组织可使脂肪组织在光学上变得透明。与在全安装染色中观察到的不以相同放大率清除组织相比，通过组织清除的脂肪组织的免疫标记显示神经节化密度要高得多。
在尝试此过程时，重要的是要记住，在 PFA 的室温下不要过度固定样品一小时，否则，这会增加背景自荧光。但是，如果样品固定在摄氏四度，则固定期可能会延长。按照这个程序，其他方法，如使用 ImageJ 的定量，可以执行，以回答其他问题，如细胞结构，如脂肪细胞位点和血管密度，如何随着各种生理条件的变化。
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