Biology
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माउस एपिडरमल केराटिनोसाइट्स और उनके इन विट्रो क्लोनोजेनिक संस्कृति का अलगाव
Chapters
Summary August 10th, 2019
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इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य आणविक जीव विज्ञान, जैव रसायन, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई, और प्राथमिक इन विट्रो का उपयोग करता है (जैसे, क्लोनोजेनिक) जैसे बहाव अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए वयस्क चूहों के पृष्ठीय त्वचा से epidermal keratincytes को अलग करने के लिए है केराटिनोसाइट्स)।
Transcript
वयस्क चूहों से एपिडर्मल कोशिकाओं की कटाई के लिए हमारी विधि केराटिनोसाइट स्टेम सेल जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है। हमारी तकनीक अत्यधिक प्रजनन योग्य है और त्वचा कार्सिनोजेनेसिस मॉडल के संदर्भ में चूहों में वीवो प्रक्रियाओं के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इच्छामृत्यु वयस्क चूहों से पृष्ठीय त्वचा के नमूनों की कटाई के बाद, एक समय बालों वाली त्वचा को एक पतली पेट्री डिश में नीचे रखने के लिए ऑटोक्लेव्ड संदंश और एक स्केलपेल का उपयोग करें और वेंट्रल त्वचा ऊतक से वसा सहित चमड़े के नीचे के ऊतकों को स्क्रैप करें जब तक कि ऊतक अर्ध पारदर्शी न हो जाए।
स्क्रैप की गई त्वचा को पीबीएस में तब तक रखें जब तक कि अन्य सभी शेष खाल संसाधित न हो जाएं। फिर त्वचा के नमूनों को एक से 1.5 सेंटीमीटर स्ट्रिप्स में 0.5 में काटने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। स्ट्रिप्स बालों वाली ओर एक बाँझ पेट्री डिश में एक 20 मिलीलीटर PBS प्लस दो एक्स gentamicin समाधान की सतह पर बालों की ओर तैर से पहले जगह है, एक प्लास्टिक १०० में ०.२५% ट्रिप्सिन के साथ पूरक 32 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए 20 मिलीमीटर पेट्री डिश ।
इनक्यूबेशन के अंत में, एक बाँझ, प्लास्टिक, स्क्वायर पेट्री डिश रखें जिसमें 30 डिग्री झुकाव पर 15 मिलीलीटर कटाई माध्यम होता है और एक फ्लोटिंग त्वचा पट्टी को ध्यान से डिश में स्थानांतरित करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। त्वचा के लिए एक लंबवत कोण पर एक नया स्केलपेल ब्लेड पकड़े और पर्याप्त लेकिन अत्यधिक बल का उपयोग नहीं, एपिडर्मिस और नमूने से माध्यम में बाल स्क्रैप । जब सभी स्ट्रिप्स को स्क्रैप कर दिया गया हो, तो ध्यान से एपिडर्मल सेल को एक बाँझ 60 मिलीलीटर जार में कम करें जिसमें 1.5 इंच चुंबकीय हलचल बार होता है और पेट्री डिश को अतिरिक्त कटाई माध्यम से कुल्ला करता है ताकि किसी भी शेष एपिडरमल कोशिकाओं को इकट्ठा किया जा सके।
ताजा माध्यम के साथ 30 मिलीलीटर के लिए जार में अंतिम मात्रा लाओ, और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्रति मिनट १०० घूर्णन पर एपिडर्मल सेल समाधान हलचल । एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में सरगर्मी इनक्यूबेशन के अंत में हलचल बार को हटाने और एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक 70 माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से सेल समाधान फिल्टर। संदंश का उपयोग करें और फिर छलनी के माध्यम से बाल और स्ट्रैटम कॉर्नियम सामग्री प्रेस करने के लिए ऊतक में हेरफेर करने के लिए फंस बाल कोशिकाओं को रिहा करने और कटाई माध्यम के एक अतिरिक्त पांच मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए ट्यूब में फंसे हुए बाल कोशिकाओं को रिहा ।
यह महत्वपूर्ण है कि एपिडर्मल कोशिकाओं और बालों में हेरफेर किया जाता है ताकि बालों के रोम से कोशिकाओं को छोड़ दिया जा सके। ट्यूब में कुल मात्रा को ताजा माध्यम के साथ 50 मिलीलीटर तक लाएं और अपकेंद्रित्र द्वारा सेल फिल्ट्रेट एकत्र करें। 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ लगभग 20 ट्राइट्यूशन में ताजा कटाई माध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें।
एक से 20 कमजोर पड़ने के 0.5 मिलीलीटर लें और इसे 2 मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। नमूना को ध्यान से मिलाने के बाद, माइक्रोफ्यूज ट्यूब से 200 माइक्रोलीटर लें और धीरे-धीरे 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन की बराबर मात्रा के साथ मिलाएं। धीरे-धीरे इस समाधान को तीन बार मिलाएं और कोशिकाओं को नाभिित केराटिनोसाइट्स की गिनती के लिए हीमोसाइटोमीटर में स्थानांतरित करें।
सभी गहरे नीले रंग की कोशिकाओं को अव्यवहार्य कोशिकाओं के रूप में स्कोर करें और व्यवहार्य कोशिकाओं के रूप में छोटे सोने और गुलाबी कोशिकाओं को स्कोर करें। व्यवहार्यता औसत के बारे में 80% और माउस प्रति अंतिम keratinocyte उपज के बारे में 30 मिलियन व्यवहार्य कोशिकाओं होना चाहिए. गिनती के बाद, एक और अपकेंद्रित्र के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा, और जन संस्कृति के लिए सेल संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में 35 मिलीमीटर पेट्री डिश प्रति छठे व्यवहार्य keratinocytes के लिए दो से चार बार 10 फिर से खर्च करें।
एक क्लोनोजेनिक कॉलोनी गठन परख के लिए, एक्स-रे विकिरणित स्विस माउस 3T3 फीडर परतों पर 60 मिलीमीटर पेट्री डिश प्रति सीरम एकाग्रता में पूरक के साथ संशोधित विलियम ई माध्यम के चार मिलीलीटर के लिए एक बार 10 से तीसरे keratinocytes के लिए कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। जन संस्कृति के लिए, उपयुक्त सेल संस्कृति अवधि के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 32 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को विकसित करें। जन संस्कृति के लिए प्रारंभिक सीडिंग के 24 घंटे बाद और उसके बाद सप्ताह में तीन बार माध्यम बदलना।
क्लोनल संस्कृति के अंत में मध्यम को बढ़ाया जाता है और कमरे के तापमान पर रात में 10% बफर फॉर्मेलिन में कॉलोनियों को ठीक करता है। अगली सुबह, एक घंटे के लिए ऑटोक्लेव पानी में ०.५% रोडामाइन बी के साथ कालोनियों दाग, ठंडे ऑटोक्लेव पानी में व्यंजन धोने से पहले जब तक पानी स्पष्ट चलाता है । फिर कॉलोनियों की गिनती से पहले सूखने के लिए उनके ढक्कन पर व्यंजन झुकाएं।
यहां, विभिन्न सामयिक उपचारों के दिखाए जाने के बाद केराटिनोसिटे कॉलोनी गठन के विशिष्ट परिणाम दिखाई देते हैं। बाल कूप स्टेम सेल आम तौर पर वयस्क C57BL/6 माउस पृष्ठीय त्वचा से अलग कोशिकाओं के लगभग 9% बनाने के रूप में प्रवाह साइटोमेट्रिक माउस बाल कूप स्टेम सेल मार्कर के लिए धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया । इस आंकड़े में चार विभिन्न मध्यम परिस्थितियों में संस्कृति के बाद केराटिनोसिटे स्टेम सेल कालोनियों की विकास विशेषताओं को देखा जा सकता है।
इस प्रक्रिया के बाद, कोशिकाओं का उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री, फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई, सेल संस्कृति और आणविक जैविक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक ने हमें यह निर्धारित करने में सक्षम बनाया है कि एपिडर्मल स्टेम सेल की संख्या एक मात्रात्मक और जटिल विशेषता है जिससे एक नए स्टेम सेल नियामक जीन की पहचान की जा रही है ।
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